微卫星又称简单序列重复(SSR),在真核生物基因组中大量存在,具有变异丰富、多态性高、共显性等特征,是一种非常有用的分子标记,已广泛应用于遗传作图、基因定位、种质鉴定、分子标记辅助育种等。烟草(Nicotianatabacum L.)是重要的经济作物。烟草中已经开发了很多SSR标记,并已构建高密度的SSR标记遗传图谱。但由于烟草的遗传多样性较低,必须开发更多的SSR标记才能满足遗传研究和育种应用的需要。随着二代测序技术的发展,三个烟草品种(BX、TN90和K326)的基因组被测序并发表,为大规模开发烟草SSR标记提供了宝贵的数据。利用这些数据,本研究对烟草SSR进行全面搜索和分析,通过引物设计和多态性检测开发SSR标记,并根据与已发表的SSR标记的连锁关系,将部分新开发的SSR标记定位到烟草遗传图谱上。另外,根据所得结果,还构建了烟草SSR标记数据库。主要结果如下:(1)共搜索到630,742个SSR。其中,14.44%为三品种共有,27.97%为两品种共有,57.58%为单品种特有。(2)在不同重复类型的SSR中,以双碱基重复的数量最多,三碱基重复次之,第三为五碱基重复。(3)就各种基序而言,单碱基A/T多于G/C;双碱基以AT/TA最多,GC/CG最少;三碱基以AAC/GTT最多,CGC/GCG的数量最少。总体看,GC含量越高则数量越少。(4)在三个品种中,大约3/5的SSR成功设计出PCR引物,具有开发成为分子标记的潜力。(5)在两品种或三品种间共有的SSR中,有17.39%在品种间表现出多态性,其中以双碱基类型最多,三碱基类型次之。(6)通过e-PCR将已发表的SSR标记定位到三个烟草品种的scaffold中,从而将相应的scaffold定位到遗传图谱上。进一步根据scaffold中的位置关系,将大量新开发的SSR标记(约46,000个)定位了到烟草遗传图谱中,使遗传图谱的密度大约增加了 20倍以上。本研究结果极大增加了烟草SSR标记的数量,将促进烟草遗传研究和分子育种的发展。