鼻咽癌是我国南方及亚洲中国人种高发的头颈部肿瘤，中晚期鼻咽癌患者5-10年生存率仅有40％左右，局部复发和远处转移是影响患者生存率的主要因素。目前所采用的放化疗在治疗鼻咽癌时常发生严重的并发症，影响患者生活质量，这就需要我们更积极地寻找全身综合治疗手段，预防和治疗鼻咽癌的复发和转移，全面提高鼻咽癌的总生存率，改善生存质量。随着肿瘤生物学的发展，肿瘤的生物治疗已逐渐成为治疗恶性肿瘤的第四模式，肿瘤的生物治疗在肿瘤综合治疗中发挥越来越大的作用。干扰素（IFN）作为主要的肿瘤生物治疗制剂之一，以其抑制肿瘤相关病毒的繁殖、抑制肿瘤细胞增生和诱导分化、促进凋亡，免疫调节及抑制肿瘤血管生成等功能，已被广泛应用于治疗14种以上的恶性肿瘤。但干扰素在鼻咽癌的治疗作用了解不多。本研究通过体内外实验，探讨干扰素对EB病毒阳性鼻咽癌细胞生长、转移的作用。目前临床使用干扰素为蛋白制剂，蛋白形式的干扰素在体内半衰期短，需长期给药，使用药量大且血药浓度并不稳定，易出现全身各系统的毒副作用，目前认为干扰素抗肿瘤作用效果有限，这可能与干扰素在体内很难达到有效治疗剂量有关等。针对干扰素治疗肿瘤策略上存在的问题，本实验以重组腺相关病毒（rAAV）作为转基因载体，介导干扰素基因的表达，使机体细胞长期稳定表达基因，产生有生物活性的干扰素蛋白，同时以临床常规外源性干扰素治疗方法为对照，探讨干扰素在鼻咽癌的治疗作用及作用机制，为鼻咽癌生物治疗提供有价值的理论依据。一、重组腺相关病毒（rAAV）载体的包装与鉴定采用分子克隆的方法将IFN-α表达序列插入pAAV质粒的BamHⅠ及EcoRⅠ酶切位点之间，将EGFP表达序列插入pAAV质粒的XhoⅠ及EcoRⅠ酶切位点之间分别成功构建pAAV-IFN-α及pAAV-EGFP；采用无辅助病毒的双质粒共转染方法，pAAV-IFN-α（或pAAV-EGFP）及rAAV包装辅助质粒pDG共同转染HEK-293FT细胞，包装病毒；采用氯仿处理-PEG／NaCL沉淀-氯仿抽提3个步骤分离、浓缩和纯化重组腺相关病毒（rAAV）。通过Real-Time PCR定量检测，确定包装病毒滴度均介于10¹¹v.g.／ml～10¹²v.g.／ml之间。通过不同滴度rAAV-EGFP转染C666-1细胞，其结果显示48小时以5×10⁴v.g.／细胞转染效率最高，达95％以上，纯化后的rAAV仍保持较强的感染性。RT-PCR及Western结果显示IFN-α在转录及翻译水平表达，表明rAAV-IFN-α载体的高效性。二、rAAV-IFN-α对EBV（+）鼻咽癌细胞株的作用研究IFN-α蛋白抑制EBV（+）鼻咽癌细胞株C666-1细胞生长的半数抑制剂量（IC50）实验；rAAV-IFN-α转染C666-1细胞的细胞增殖实验（MTT）；rAAV-IFN-α转染C666-1细胞流式细胞检测；细胞凋亡检测；RT-PCR鉴定rAAV-IFN-α转染C666-1细胞后IFN-α表达及转移相关基因表达变化；高效液相芯片技术（Liquichip）检测rAAV-IFN-α转染C666-1细胞后细胞上清中人IFN-α的含量。数据采用SPSS10.0统计软件包进行统计学处理。结果显示：采用MTT试验，当IFN-α蛋白浓度达到1×10⁵IU／ml，C666-1细胞增殖明显受抑制（达50％），即IC50；MTT试验显示，rAAV-IFN-α转：染C666-1细胞培养48小时至72小时后，细胞平均吸光度与对照组比较无统计学差异（F=1.181，p=0.334）。流式细胞术结果显示，与对照组比较，rAAV-IFN-α转染48小时后能改变C666-1细胞周期，使G1期细胞比例增加（F=39.675，P=0.000），效果优于IFN-α蛋白，但无统计学差异（P=0.059）。运用三种细胞凋亡检测方法结果显示，体外IC50浓度的IFN-α及rAAV-IFN-α均不能引起C666-1细胞明显凋亡。RT-PCR显示rAAV介导IFN-α表达后显著抑制C666-1细胞中EB病毒LMP-1及EBNA-1的表达，并下调肿瘤细胞MMP-9及VEGF的表达，IC50浓度的IFN-α亦能引起相同效应，但效果较弱。高效液相芯片技术（Liquichip）检测结果显示rAAV-IFN-α转染C666-1细胞后培养上清中IFN-α的含量随培养时间延长而增加，但培养至72小时总体浓度仍低于20U／ml。三、rAAV介导IFN-α基因对EBV（+）鼻咽癌肝移植瘤生长和转移的实验研究BALB／c-nu／nu雄性裸鼠64只建立EBV（+）鼻咽癌肝移植瘤动物模型。将64只裸鼠随机分成4组，即A组rAAV-IFN-α组、B组IFN-α组、C组rAAV-EGFP组及D组PBS组，每组16只；其中每组随机取8只用于观察抗肿瘤效果，其余8只用于生存期观察。观察rAAV-IFN-α、IFN-α对裸鼠鼻咽癌肝移植瘤生长和转移抑制的效应。免疫组化检测移植瘤组织中MMP-9的表达和微血管密度（MVD）。原位末端标记（TUNEL法）检测肝脏移植瘤肿瘤细胞凋亡。RT-PCR分析肿瘤组织IFN-α表达及转移相关基因表达变化。高效液相芯片技术检测血清中人IFN-α及鼠IL-12、GM-CSF、IFN-r、IL-2、IL-10、TNF-α的含量。确定不同组动物的生存期。数据采用SPSS10.0统计软件包进行统计学处理。结果显示：肝脏鼻咽癌移植瘤3周后，A、B、C、D组肿瘤平均体积分别为（239.00±44.80）mm³、（340.25±75.96）mm³、（424.75±67.22）mm³、（430.75±112.05）mm³，四组肿瘤体积经方差分析提示有非常显著意义（F=10.397，P=0.000），经多重比较rAAV-IFN-α与其他三组差异均有显著意义（P=0.000），IFN-α组与EGFP及PBS组比较均有显著差异（P=0.029），而EGFP组与PBS组比较差异无显著意义（P=0.880）。A、B、C、D组肝内转移分别为12.5％、37.5％、100％、100％；肺转移为0.0％、50.0％、87.5％、100％；平均生存期分别为（18.25±2.49）天、（15.13±1.13）天、（12.88±1.25）天、（12.63±1.19）天，4组之间有显著统计学差异（F=20.848，P＜0.001），其中rAAV-IFN-α生存时间较IFN-α组（P=0.001）及对照组（P=0.000）显著延长，IFN-α组较EGFP组与PBS组亦显著延长（P＜0.01）。凋亡平均指数分别为（12.20±1.92）、（8.80±1.64）、（4.00±1.58）、（3.40±1.14），经单因素方差分析差异有非常显著意义（F=34.118，P=0.000），多重比较提示A组较其他三组均有显著差异，IFN-α较rAAV-EGFP及PBS组亦有显著差异（P=0.000），而rAAV-EGFP与PBS组间无统计差异（P=0.561）。rAAV-IFN-α及IFN-α组移植鼻咽癌肿瘤组织MMP-9表达较rAAV-EGFP及PBS组显著下降，经秩和检验差异有显著差异（P=0.000）。rAAV-IFN-α及IFN-α组肝脏移植鼻咽癌肿瘤组织MVD（1.60±1.14）、（1.80±0.84）较对照组（13.00±2.74）、（13.20±2.59），明显下降，经单因素方差分析差异有非常显著意义（F=53.498，P=0.000）。RT-PCR结果显示rAAV-IFN-α组肝脏移植鼻咽癌细胞内有IFN-αmRNA表达，在IFN-α组及对照组无IFN-αmRNA表达。在rAAV-IFN-α组及IFN-α组鼻咽癌细胞MMP-9mRNA、VEGFmRNA表达与对照组比较表达下降。用rAAV-IFN-α及IFN-α治疗荷瘤裸鼠后3周，A、B、C、D组裸鼠血清中IFN-α含量（U／ml，（?）±s）分别为（7.01±2.68）（5.59±1.42）（1.81±0.48）、（1.30±0.34），rAAV-IFN-α组血清中IFN-α的含量较IFN-α组含量高，但无统计学差异（P=0.126），但较对照组显著升高（P=0.000）；检测四组裸鼠血清中IL-12含量分别为（pg／ml，（?）±s）（105.02±43.43）（56.99±13.93）（0.00±0.00）（0.00±0.00），rAAV-IFN-α组较IFN-α组（P=0.002）及对照组比较均有显著统计学差异；四组裸鼠血清中GM-CSF含量（pg／ml，（?）±s）分别为（105.23±21.05）、（100.52±14.59）、（72.42±22.76）、（63.08±26.100），rAAV-IFN-α组比较IFN-α组无统计学差异（P=0.687），较对照组有显著增长（P＜0.01）。IFN-r、IL-2、IL-10、TNF-α四种细胞因子含量治疗组与对照组之间无统计学差异。结论：1、本研究采用的rAAV-IFN-α治疗策略能有效抑制鼻咽癌的生长和转移；从抑制移植瘤生长、转移抑制效果和生存时间比较，rAAV-IFN-α基因治疗优于外源性IFN-α蛋白治疗。2、IFN-α主要通过抑制肿瘤血管增生，免疫调节作用发挥其抗EBV（+）鼻咽癌生长和转移作用，IFN-α对EBV（+）鼻咽癌细胞的直接抑制作用有限。3、IFN-α可能通过抑制EBV LMP-1及EBNA-1基因表达发挥其抗EBV（+）鼻咽癌生长和转移作用。