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目的：
肝再生增强因子（Augmenter of liver regeneration,ALR）是一种能够特异性刺激肝细胞增殖、促进肝脏再生的细胞因子。ALR 有两种大小的存在形式，15Kd和23Kd，而15Kd ALR的主要功能是作为一个分泌到细胞外的生长因子，促进肝细胞的保护、再生和增殖。前期研究所筛选到的与ALR特异性结合的蛋白Citron kinase（CIT）在细胞有丝分裂的过程中逐渐由胞核-胞浆-胞膜移位，那么15Kd ALR是否随着CIT 的这个移位特点，通过与 CIT 特异性结合而分泌到细胞外发挥一系列生物学作用？本研究拟通过免疫荧光和免疫共沉淀再一次验证CIT与ALR二者为相互作用蛋白，探讨二者的相互影响，以及对细胞增殖及凋亡的影响，为肝癌的诊断治疗提供新方向。
方法：
1.通过激光共聚焦显微镜观察CIT与ALR在PLC/PRF/5肝癌细胞内的表达，免疫共沉淀验证CIT与ALR二者是相互作用蛋白。
2.通过Western Blot和qPCR筛选SK-Hep-1、HepG2、SMMC-7721和PLC/PRF/5四株肝癌细胞中15Kd ALR表达量相对较高的细胞进行后续实验。
3.已知肝细胞在受到损伤的情况下15Kd ALR的表达会增加，通过顺铂（Cisplatin）建立SK-Hep-1肝癌细胞药物损伤模型，用Western Blot筛选顺铂5μg/ml和10μg/ml两个浓度，1h、3h、6h、12h和24h共5个时间点中的最佳刺激浓度及时间点。
4.筛选三条针对目的基因CIT的siRNA干扰靶点序列，送公司合成后通过 Lipofectamine2000 转染试剂分别转染 SK-Hep-1 细胞，通过Western Blot和qPCR筛选最佳干扰序列，通过激光共聚焦显微镜从形态学上观察SK-Hep-1细胞中siRNA转染之后CIT的表达。
5.敲低CIT对细胞内15Kd ALR表达的影响：实验分为对照组、顺铂组、敲低组和敲低顺铂组，分别转染SK-Hep-1细胞，通过Western Blot以及激光共聚焦显微镜观察细胞内15Kd ALR表达的变化。
6.通过EdU增殖实验观察敲低CIT对SK-Hep-1肝癌细胞的增殖影响，实验分为对照组、顺铂组、敲低组和敲低顺铂组。
7.敲低 CIT 对细胞凋亡的影响：实验分为对照组、顺铂组、敲低组和敲低顺铂组，分别转染SK-Hep-1细胞，通过流式细胞仪观察细胞凋亡的变化。
结果：
1.激光共聚焦显微镜观察到CIT在整个细胞的胞核胞浆均有表达，而ALR主要表达在细胞浆，二者在细胞内的表达位置有重叠。免疫共沉淀结果显示CIT能单方面的沉淀下ALR，而ALR不能沉淀下来CIT。
2.Western Blot的结果显示SK-Hep-1、HepG2、SMMC-7721和PLC/PRF/5四株肝癌细胞中SK-Hep-1细胞内15Kd ALR的表达量相对较高，由于qPCR的结果不能区分15Kd和23Kd ALR，所以参考Western Blot的结果，选择SK-Hep-1细胞进行后续实验。
3.Western Blot的结果显示顺铂5μg/ml和10μg/ml两个浓度，1h、3h、6h、12h和24h共5个时间点，与对照组相比，均能不同程度的刺激SK-Hep-1细胞内15Kd ALR的表达，而10μg/ml、12h的作用浓度及时间点能最大程度的刺激15Kd ALR的表达，因此选择该浓度及时间点进行后续实验，内源性刺激15Kd ALR表达的细胞模型建立成功。
4.Western Blot和qPCR的结果显示，在转染三条CIT的不同干扰序列的siRNA进入SK-Hep-1细胞之后，与对照组相比，CIT的表达均有不同程度的降低，而 5?-AAGCCTGAAGTGGGAGAATAT-3?干扰靶点序列降低最为明显，为最佳干扰靶点。激光共聚焦显微镜从形态学上也证实转染不同序列的siRNA之后，CIT的表达明显减弱。
5.Western Blot以及激光共聚焦显微镜的结果显示，与对照组相比，顺铂组及敲低组内15Kd ALR的表达均有一定程度的增加，而敲低顺铂组内15Kd ALR表达增加更为明显。
6.EdU增殖实验结果显示，顺铂组SK-Hep-1细胞的增殖高于对照组，CIT敲低组SK-Hep-1细胞的增殖明显低于对照组，而敲低顺铂组相较于单独的敲低组细胞增殖更低。
7.细胞凋亡结果显示，与对照组相比，顺铂组能明显引起细胞凋亡，而敲低顺铂组细胞凋亡增多更加明显。
结论：
1.激光共聚焦显微镜以及免疫共沉淀初步成功验证CIT与ALR二者是相互作用蛋白。
2.SK-Hep-1、HepG2、SMMC-7721和PLC/PRF/5四株肝癌细胞中15Kd ALR表达量最高的是SK-Hep-1细胞，选择SK-Hep-1细胞进行后续实验。
3.10μg/ml、12h 的顺铂刺激浓度及时间点使 SK-Hep-1 肝癌细胞15Kd ALR内源性分泌增多最明显，成功构建SK-Hep-1肝癌细胞顺铂药物损伤模型。
4. 三条针对CIT基因的干扰序列中5-AAGCCTGAAGTGGGAGAATAT-3为最佳干扰序列，干扰之后的mRNA表达量约为干扰前的29%。
5.敲低CIT细胞内15Kd ALR堆积，而同时敲低CIT之后在顺铂的刺激下细胞内15Kd ALR堆积更为明显，说明敲低CIT影响细胞内15Kd ALR分泌到细胞外。由于15Kd ALR可分泌到细胞外发挥其促进细胞增殖及抗凋亡的作用，而细胞增殖和凋亡的结果也均表明敲低CIT，15Kd ALR的促增殖和抗凋亡作用明显减弱，从功能学上证实敲低CIT影响15Kd ALR出胞发挥其生物学作用。
肝再生增强因子（Augmenter of liver regeneration,ALR）是一种能够特异性刺激肝细胞增殖、促进肝脏再生的细胞因子。ALR 有两种大小的存在形式，15Kd和23Kd，而15Kd ALR的主要功能是作为一个分泌到细胞外的生长因子，促进肝细胞的保护、再生和增殖。前期研究所筛选到的与ALR特异性结合的蛋白Citron kinase（CIT）在细胞有丝分裂的过程中逐渐由胞核-胞浆-胞膜移位，那么15Kd ALR是否随着CIT 的这个移位特点，通过与 CIT 特异性结合而分泌到细胞外发挥一系列生物学作用？本研究拟通过免疫荧光和免疫共沉淀再一次验证CIT与ALR二者为相互作用蛋白，探讨二者的相互影响，以及对细胞增殖及凋亡的影响，为肝癌的诊断治疗提供新方向。
方法：
1.通过激光共聚焦显微镜观察CIT与ALR在PLC/PRF/5肝癌细胞内的表达，免疫共沉淀验证CIT与ALR二者是相互作用蛋白。
2.通过Western Blot和qPCR筛选SK-Hep-1、HepG2、SMMC-7721和PLC/PRF/5四株肝癌细胞中15Kd ALR表达量相对较高的细胞进行后续实验。
3.已知肝细胞在受到损伤的情况下15Kd ALR的表达会增加，通过顺铂（Cisplatin）建立SK-Hep-1肝癌细胞药物损伤模型，用Western Blot筛选顺铂5μg/ml和10μg/ml两个浓度，1h、3h、6h、12h和24h共5个时间点中的最佳刺激浓度及时间点。
4.筛选三条针对目的基因CIT的siRNA干扰靶点序列，送公司合成后通过 Lipofectamine2000 转染试剂分别转染 SK-Hep-1 细胞，通过Western Blot和qPCR筛选最佳干扰序列，通过激光共聚焦显微镜从形态学上观察SK-Hep-1细胞中siRNA转染之后CIT的表达。
5.敲低CIT对细胞内15Kd ALR表达的影响：实验分为对照组、顺铂组、敲低组和敲低顺铂组，分别转染SK-Hep-1细胞，通过Western Blot以及激光共聚焦显微镜观察细胞内15Kd ALR表达的变化。
6.通过EdU增殖实验观察敲低CIT对SK-Hep-1肝癌细胞的增殖影响，实验分为对照组、顺铂组、敲低组和敲低顺铂组。
7.敲低 CIT 对细胞凋亡的影响：实验分为对照组、顺铂组、敲低组和敲低顺铂组，分别转染SK-Hep-1细胞，通过流式细胞仪观察细胞凋亡的变化。
结果：
1.激光共聚焦显微镜观察到CIT在整个细胞的胞核胞浆均有表达，而ALR主要表达在细胞浆，二者在细胞内的表达位置有重叠。免疫共沉淀结果显示CIT能单方面的沉淀下ALR，而ALR不能沉淀下来CIT。
2.Western Blot的结果显示SK-Hep-1、HepG2、SMMC-7721和PLC/PRF/5四株肝癌细胞中SK-Hep-1细胞内15Kd ALR的表达量相对较高，由于qPCR的结果不能区分15Kd和23Kd ALR，所以参考Western Blot的结果，选择SK-Hep-1细胞进行后续实验。
3.Western Blot的结果显示顺铂5μg/ml和10μg/ml两个浓度，1h、3h、6h、12h和24h共5个时间点，与对照组相比，均能不同程度的刺激SK-Hep-1细胞内15Kd ALR的表达，而10μg/ml、12h的作用浓度及时间点能最大程度的刺激15Kd ALR的表达，因此选择该浓度及时间点进行后续实验，内源性刺激15Kd ALR表达的细胞模型建立成功。
4.Western Blot和qPCR的结果显示，在转染三条CIT的不同干扰序列的siRNA进入SK-Hep-1细胞之后，与对照组相比，CIT的表达均有不同程度的降低，而 5?-AAGCCTGAAGTGGGAGAATAT-3?干扰靶点序列降低最为明显，为最佳干扰靶点。激光共聚焦显微镜从形态学上也证实转染不同序列的siRNA之后，CIT的表达明显减弱。
5.Western Blot以及激光共聚焦显微镜的结果显示，与对照组相比，顺铂组及敲低组内15Kd ALR的表达均有一定程度的增加，而敲低顺铂组内15Kd ALR表达增加更为明显。
6.EdU增殖实验结果显示，顺铂组SK-Hep-1细胞的增殖高于对照组，CIT敲低组SK-Hep-1细胞的增殖明显低于对照组，而敲低顺铂组相较于单独的敲低组细胞增殖更低。
7.细胞凋亡结果显示，与对照组相比，顺铂组能明显引起细胞凋亡，而敲低顺铂组细胞凋亡增多更加明显。
结论：
1.激光共聚焦显微镜以及免疫共沉淀初步成功验证CIT与ALR二者是相互作用蛋白。
2.SK-Hep-1、HepG2、SMMC-7721和PLC/PRF/5四株肝癌细胞中15Kd ALR表达量最高的是SK-Hep-1细胞，选择SK-Hep-1细胞进行后续实验。
3.10μg/ml、12h 的顺铂刺激浓度及时间点使 SK-Hep-1 肝癌细胞15Kd ALR内源性分泌增多最明显，成功构建SK-Hep-1肝癌细胞顺铂药物损伤模型。
4. 三条针对CIT基因的干扰序列中5-AAGCCTGAAGTGGGAGAATAT-3为最佳干扰序列，干扰之后的mRNA表达量约为干扰前的29%。
5.敲低CIT细胞内15Kd ALR堆积，而同时敲低CIT之后在顺铂的刺激下细胞内15Kd ALR堆积更为明显，说明敲低CIT影响细胞内15Kd ALR分泌到细胞外。由于15Kd ALR可分泌到细胞外发挥其促进细胞增殖及抗凋亡的作用，而细胞增殖和凋亡的结果也均表明敲低CIT，15Kd ALR的促增殖和抗凋亡作用明显减弱，从功能学上证实敲低CIT影响15Kd ALR出胞发挥其生物学作用。