论文部分内容阅读
目的:通过对人类条件致病菌粪肠球菌噬菌体和植物致病菌茄科雷尔氏菌噬菌体的生物学特性及基因组学特征的研究,为噬菌体治疗和噬菌体基因组学的深入研究提供理论依据。方法:以人类条件致病菌粪肠球菌（2003）为指示菌从医院污水中分离粪肠球菌噬菌体vBEfaPIME195,同时以植物致病菌茄科雷尔氏菌（JW20）为指示菌从姜地土壤中分离茄科雷尔氏菌噬菌体GP4。通过对两株噬菌体在琼脂双层平板上裂解宿主细菌后形成的噬菌斑、透射电子显微镜下噬菌体的形态、噬菌体的最佳感染复数、一步生长曲线、温度敏感性、氯仿敏感性以及裂解谱的观察,分析噬菌体的生物学特性。通过二代高通量测序法对两株噬菌体进行测序,测序后组装、拼接噬菌体的全基因组序列,将得到的全基因组序列进行基因组注释、进化树和末端分析。结果:（1）本研究以医院临床妇产科女性患者分泌物和呕吐物中分离到的粪肠球菌（菌株2003）作为指示菌从医院污水中分离到了一株粪肠球菌噬菌体,命名为vBEfaPIME195（简称:IME195）。该噬菌体通过PBS缓冲液梯度稀释、双层培养基平板法培养得到边缘分明、斑体透明的噬菌斑;电镜照片显示噬菌体IME195属于短尾噬菌体科（Podoviridae）,其衣领部位有一个特殊的环,这是短尾噬菌体科中Picovirinae亚科噬菌体所具有的特征。噬菌体IME195的最佳感染复数（Optimum complex number of infections,MOI）为0.01,一步生长曲线显示其潜伏期约为30min,裂解量约为120 PFU/Cell。该噬菌体的裂解谱较窄,对高温较敏感,但对5%氯仿不敏感。通过二代高通量测序获得噬菌体IME195的全基因组序列,显示该噬菌体基因组为线性、双链DNA,基因组大小只有18655bp,GC含量仅有33.2%（GenBank登录号:KT932700）。经RAST注释后仅得到27个开放阅读框（ORFs）,其中15个ORF为假象蛋白,12个ORF为已知功能蛋白。Run-off测序结果显示,噬菌体IME195末端有59bp的反向重复序列,与屎肠球菌噬菌体IME199的末端相似。经BLASTn比对,噬菌体IME195与一株已提交基因组序列而未发表相关论文的噬菌体有92%的相似性,与其他在NCBI库中的噬菌体的同源性较低。（2）本研究还以茄科雷尔氏细菌（JW20）为指示菌,从姜地土壤中分离了一株茄科雷尔氏菌噬菌体GP4,该噬菌体亦属于短尾噬菌体科。噬菌体GP4的最佳感染复数（MOI）为10-6,一步生长曲线显示该噬菌体的潜伏期约为2h,裂解量约为106 PFU/Cell。噬菌体GP4在40℃-70℃具有较强的生物活性,裂解谱显示,能被裂解的16株茄科雷尔氏菌均为演化型Ⅳ型菌,而演化型I型菌均不能被噬菌体GP4裂解。通过二代高通量测序获得全长为61129bp的双链DNA基因组序列,GC含量为64%（GenBank登录号:MH638294）。经RAST在线注释,该噬菌体具有83个开放阅读框（ORFs）,其中72个ORF的起始密码子为ATG,11个ORF的起始密码子为GTG。这83个ORF中24个为功能蛋白,12个为结构蛋白,其余47个为假象蛋白。通过tRNAscan-SE 2.0在线软件在噬菌体GP4基因组的25202bp和25291bp之间找到一大小为90bp的半胱氨酸tRNA（tRNA-cys）。经BLASTn比对,噬菌体GP4与Bcep22样病毒中的四株噬菌体具有同源性,但同源区覆盖率较低,覆盖率分别为Bcep22（13%）、BcepIL02（13%）、DC1（13%）以及BcepMigl（13%）。利用本研究室建立的末端分析技术,在该噬菌体中没有找到固定末端,提示该噬菌体基因组末端是随机的。结论:（1）粪肠球菌噬菌体IME195,属于短尾噬菌体科Picovirinae亚科。其基因组较小,末端较特殊,具有59bp的反向重复序列。所以这种简单、特殊的噬菌体可以做为其他噬菌体基因组研究的模型。（2）茄科雷尔氏菌噬菌体GP4,属于短尾噬菌体科Bcep22样病毒。生物学特性实验表明,该噬菌体能裂解大部分演化型Ⅳ型的茄科雷尔氏菌,所以可以将其做为青枯菌抗菌生物制剂。