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本研究将野蔷薇(Rosa multiflora)白粉病抗性基因RmMlo的反义表达载体及过表达载体分别导入月季植株材料,并对转基因和非转基因月季材料进行抗性鉴定,以期对该基因回到原作物中的功能进行分析和验证。 在建立白粉病抗性、感性月季材料离体再生体系的基础上,本研究构建RmMlo基因的反义表达载体pFGC5941-anti-RmMlo,再应用农杆菌介导法将反义表达载体及过表达载体pBI121-RmMlo对月季进行转化,通过对体细胞胚的侵染、筛选、再分化获得PCR扩增阳性苗,最后对转基因苗进行分子鉴定和抗性评价。主要研究结果如下: 1、以野蔷薇(白粉病抗性材料)、‘月月粉’(R.chinensis‘Pallida’,白粉病感性材料)带腋芽的茎段为外植体,建立组织快繁体系,并利用器官间接发生途径构建体细胞胚的离体再生体系。结果表明:野蔷薇体细胞胚最佳诱导培养基是MS+3.0mg/L2,4-D+400mg/L L-p+10mg/L AgNO3+3%葡萄糖+0.3%植物凝胶,诱导率为4.18%;‘月月粉’体细胞胚最佳诱导培养是MS+1.0mg/L2,4-D+200mg/LL-p+5mg/L AgNO3+3%葡萄糖+0.3%植物凝胶,诱导率为2.03%。 2、根据课题组已获得的含野蔷薇RmMlo基因(GenBank登录号:JF310747)全长片段的重组质粒pMD18-anti-RmMlo,将目的基因片段插入到植物表达载体pFGC5941中,成功构建该基因的反义表达载体pFGC5941-anti-RmMlo。 3、将构建好的RmMlo反义表达载体及过量表达载体pBI121-RmMlo利用农杆菌介导法,分别对两种月季材料的体细胞胚进行遗传转化。实验结果表明:最佳转化条件为农杆菌菌液OD600=0.6-0.8,对野蔷薇侵染30min,共培养4d;对‘月月粉’侵染20min,共培养3d,筛选培养添加Km50mg/L、Cef300mg/L。野蔷薇转化率最高可达23.3%,‘月月粉’转化率最高为20%。 4、经卡那霉素(Km)抗性初步筛选出转基因月季苗,对获得的转基因植株采用标记基因、目的基因PCR检测。实验结果表明,有4株野蔷薇、3株‘月月粉’抗性苗均检测到标记基因和目的基因片段,证明目的基因已整合到月季基因组中。 5、对野蔷薇和‘月月粉’的转基因苗和非转基因苗,进行实时荧光定量QPCR法检测,结果表明,转入过量RmMlo基因的野蔷薇幼苗中Mlo表达量显著增高;转入anti-RmMlo基因的‘月月粉’幼苗中Mlo表达量则明显降低。 6、用白粉病菌分别侵染野蔷薇、‘月月粉’的转基因苗和非转基因苗,对白粉菌侵染过程进行显微观察。实验结果表明,过量RmMlo基因的导入加速白粉菌的生长;而anti-RmMlo基因的导入则显著抑制白粉菌的生长,从而使转anti-RmMlo基因的‘月月粉’植株表现出抗病性。