目的：　　从组织、细胞和分子水平系统的探讨PM2.5水溶成分对体外培养人卵巢颗粒细胞的增殖凋亡、性激素分泌水平及合成通路因子表达、氧化应激水平的影响及作用机制，探讨PM2.5水溶成分对女性生殖能力的影响，为明确PM2.5水溶成分对女性生殖毒性作用提供理论基础，为应对PM2.5对女性生殖系统潜在危害提供治疗方案的科学依据。　　方法：　　1、 PM2.5采集、提取成分：采用TH-150A型智能中流量总悬浮微粒无碳刷采样器，PM2.5切割器配合使用，以0.1m3/min采集，每24小时收集滤膜，采集前后采样膜进行干燥称重，计算PM2.5采集重量。提取后悬液经真空冷冻干燥仪冻成干粉。　　2、 PM2.5水溶成分染毒液配制：称取一定量的PM2.5水溶性干粉，　　用生理盐水配制成不同浓度梯度的PM2.5水溶成分溶液，溶液浓度为3mg/ml，于无菌超净台中，将该溶液通过0.22μm滤膜于无菌离心管，再以不同浓度配制于DMEM细胞培养液中，使其终浓度分别为100μg/ml，200μg/ml，300μg/ml。　　3、收取符合标准的患者的卵泡液，分离、培养人卵巢颗粒细胞。同时，选用促卵泡生成素受体对细胞进行鉴定，CCK-8法测定生长曲线，检测细胞的性激素分泌。　　4、以体外培养48小时的人卵巢颗粒细胞为靶细胞，采用PM2.5水溶成分染毒液终浓度为100μg/ml，200μg/ml，300μg/ml的DMEM培养液体外染毒24h，通过测定CCK-8检测颗粒细胞活力变化，测定LDH露出率检测颗粒细胞细胞膜受损程度，测定细胞上清液中雌二醇、孕酮激素分泌水平，免疫细胞化学染色法检测人卵巢颗粒细胞 FSHR受体表达情况，Hoechst荧光染色观察颗粒细胞凋亡情况。　　5、运用 Western blot法及 RT-PCR法检测体外卵巢颗粒细胞性激素合成通路STAR、CYP11A1、3β-HSD、17β-HSDΙ、17β-HSD II和 P450arom相关蛋白表达水平及基因表达差异，观察颗粒细胞性激素受体 PR、ER的表达量。　　6通过检测细胞培养液及细胞分泌蛋白中的ROS、SOD、MDA水平，评估颗粒细胞氧化应激水平。　　结果：　　1、人卵巢颗粒细胞分离、鉴定与体外培养：⑴提取卵巢颗粒细胞台盼蓝染色显示卵巢颗粒细胞存活率＞95％；⑵颗粒细胞表达FSHR阳性率＞90%；⑶光镜下观察随着体外培养时间延长，颗粒细胞不断贴壁增殖，24h内增殖缓慢，48h贴壁完全，增殖快速，细胞之间形成丝状突起连接，第3—5天达到增殖分裂高峰，第6、7天细胞开始凋亡、逐渐退化消融；⑷采用 CCK-8法测定细胞增殖曲线，结果显示人卵巢颗粒细胞24h内生长缓慢，培养48h增殖迅速，到第5-7d细胞开始退化；⑸人卵巢颗粒细胞分泌雌二醇、孕酮水平随着体外培养时间逐渐增高，于第6、7天逐渐降低；外源性给予组重组人促卵泡激素rFSH，颗粒细胞分泌雌二醇水平明显增高，而对于孕酮分泌没有明显改变，符合卵巢颗粒细胞原有的特性。　　2、 PM2.5水溶成分对卵巢颗粒细胞一般生殖毒性的影响：本实验建立 PM2.5水溶成分不同浓度梯度的人卵巢颗粒细胞模型，⑴随着染毒剂量及时间的增加，人卵巢颗粒细胞的相对活力下降，且差异具有统计学意义（P＜0.05）；⑵随着PM2.5水溶成分染毒剂量增加，细胞上清液中的雌二醇、孕酮激素分泌水平随之降低，呈明显的剂量—效应关系，差异具有统计学意义（P＜0.05）；⑶随着PM2.5染毒浓度的增加，颗粒细胞内LDH的含量明显降低，存在剂量—反应关系，细胞培养液中的LDH漏出含量随着染毒剂量增加而明显增加，存在剂量—反应关系；⑷随着PM2.5水溶成分染毒剂量的增加，高剂量颗粒细胞组内出现大量的凋亡细胞，差异具有统计学意义（P＜0.05）。　　3、 PM2.5水溶成分对性激素合成通路关键因子及受体的蛋白及分子水平影响：⑴随着染毒剂量的增加，颗粒细胞FSHR、ER、PR免疫细胞化学染色程度降低。半定量计数分析显示，卵巢颗粒细胞FSHR、PR、ER表达水平与对照组比较呈明显减少，差异具有统计学意义（P＜0.05），并且随染毒剂量增加明显降低；⑵PM2.5水溶成分体外染毒卵巢颗粒细胞，性激素合成通路CYP11A1、3β-HSD、17β-HSDⅠ及17β-HSDII基因相对表达水平与对照组比较明显降低（P＜0.05），而各组P450arom、STAR基因相对表达水平无明显差异（P＞0.05），Western blot与RT-PCR结果一致，CYP11A1、3β-HSD、17β-HSDⅠ及17β-HSDII蛋白表达随着染毒剂量增加而下降，差异具有统计学意义（P＜0.05），P450arom、STAR蛋白表达各种无明显变化。　　4、 PM2.5水溶成分对颗粒细胞氧化应激水平影响：随着染毒剂量增加，颗粒细胞内活性氧ROS的荧光强度明显增加，高剂量组荧光强度明显高于对照组和低剂量组，颗粒细胞内MDA含量明显增加，SOD抗氧化能力降低，与对照组相比差异具有统计学意义（P＜0.05）。　　结论：　　1、建立稳定的人卵巢颗粒细胞体外培养体系，PM2.5水溶成分染毒在本实验染毒剂量范围内能够降低人卵巢颗粒细胞相对活力，抑制颗粒细胞增殖，细胞膜受损程度增加，抑制性激素分泌水平，增加卵巢颗粒细胞总凋亡率。　　2、 PM2.5水溶成分体外染毒降低卵巢颗粒细胞性激素合成通路CYP11A1、3β-HSD、17β-HSDⅠ及17β-HSDⅡ蛋白和基因表达水平及性激素受体表达程度，降低颗粒细胞E2、P4分泌，干扰体外颗粒细胞的正常内分泌功能。　　3、 PM2.5水溶成分体外染毒诱导颗粒细胞ROS产生，增加MDA含量，SOD活性降低，增加颗粒细胞氧化应激损伤。　　总之，PM2.5水溶成分能够对女性生殖内分泌功能产生影响，诱导人卵巢颗粒细胞发生氧化应激损伤，具有一般生殖毒性，影响性激素合成水平，对女性具有一定的生殖内分泌干扰作用。