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研究背景:癌症是一类以细胞异常增殖为特征的疾病,作为人类死亡的主要原因之一,它引起了世界各地临床研究人员的高度重视。纳米医学最近在癌症治疗领域取得了令人瞩目的进展。然而,这些药物的生物相容性和靶向渗透释放仍然存在一定的局限性,并导致了严重的副作用,极大地缩小了它们的临床应用范围。自组装衍生肽可以在一定条件下,通过不同链内及链间形成的静电、疏水力、π-π堆积、离子键或氢键等作用诱导纳米颗粒结构的自组装。非免疫原性的天然氨基酸作为自组装肽具有良好的生物相容性,进一步修饰可能可以解决组织穿透受限的问题。人波形蛋白中间丝（IFs）是细胞骨架的基本成分,它能以α-螺旋同源二聚体的形式实现与微丝、微管等有形成分的交联。本研究利用其多变的延展及收缩属性能促进多肽多样化三维空间结构的形成,选择其一段含有36个氨基酸的极为保守的α-螺旋基序作为本自组装肽的主序列区,以通过平行的螺旋“棒”状结构域形成聚合物形状。7-氨基放线菌素D（7-AAD）作为抗肿瘤药物放线菌素D（ACTD）的同源结构类似物,在保留2个环肽结构的情况下,其连接链上的第7位氢原子被氨基取代,通过分子内电荷转移效应可发射荧光,并保留其结合DNA的功能。7-AAD的斯托克位移约为100 nm,可有效抑制染料的自猝灭并可减少非特异性的背景荧光,使7-AAD具有潜在的成像诊断和治疗的价值。研究目的:本研究基于自组装多肽和7-AAD的各自属性,旨在设计并合成一个具有肿瘤靶向和p H响应,可用于肿瘤成像及治疗的双功能纳米探针。研究方法:1.RGD-IFP/7-AAD自组装肽纳米探针的设计及分子对接以荧光光谱仪检测7-AAD的发光特征,琼脂糖凝胶电泳和紫外-可见光谱分析7-AAD与DNA的结合作用。Novopro在线工具分析RGD-IFP肽的疏水及电荷性质,PDB数据库和SWISS-MODEL在线工具构建其同源三级结构,MOE软件运行RGD-IFP与7-AAD的分子对接计算与分析。2.RGD-IFP/7-AAD纳米探针的制备与表征通过便捷的一步法使RGD-IFP包封7-AAD自组装成有序的纳米颗粒（RGD-IFP/7-AAD）。利用透射电镜（TEM）、动态光散射（DLS）、荧光光谱、Zeta电位、X光电子能谱（XPS）、圆二色光谱（CD）和傅里叶红外光谱（FTIR）对自组装的RGD-IFP/7-AAD纳米颗粒进行表征。以7-AAD的荧光光谱和透析法测定纳米颗粒组装和释放行为下7-AAD的含量,计算纳米颗粒的包封率、载药率及释放率。TEM表征纳米颗粒酸敏感解离形貌,DLS和Zeta电位检测纳米颗粒的体外稳定性。3.RGD-IFP/7-AAD纳米探针在体外肿瘤细胞中的作用RGD-IFP/7-AAD、IFP/7-AAD以及游离7-AAD分别与A549肺癌细胞和293T细胞共同孵育,并用Lyso-Tracker荧光探针示踪溶酶体,以激光共聚焦显微镜观察纳米颗粒在细胞内摄取和定位情况,流式细胞术进行细胞摄取强度、肿瘤细胞靶向性以及细胞周期检测分析,CCK-8实验和Ed U实验检测细胞活性和增殖情况。4.RGD-IFP/7-AAD纳米探针在荷瘤小鼠体内的荧光成像和抗瘤疗效建立人非小细胞肺癌荷瘤小鼠模型,RGD-IFP/7-AAD、IFP/7-AAD以及游离7-AAD实施尾静脉注射给药,小动物活体成像系统观察纳米探针体内荧光成像情况,组织冰冻切片的免疫荧光观察纳米探针与αvβ3整合素的体内分布。连续数天给药的治疗组,每次给药前进行体重和瘤体测量,实验终点时,离体的器官及肿瘤组织进行免疫组化染色和苏木精-伊红（H&E）染色,收集的血液进行生化和血常规分析。研究结果:1.设计的RGD-IFP自组装肽序列由三部分组成:主序列为波形蛋白中间丝36个氨基酸组成的α-螺旋肽,N端融合肿瘤靶向序列（RGD）以及负电荷载药序列（SEE,IP=3.79）,融合肽的氨基酸序列为:RGD-SEEKVELQELNDRFANYIDKVRFLEQQNKIL LAELEQL。带红色荧光（激/发波长:546/647 nm）的疏水阳离子药物7-AAD经实验表明具有结合DNA的特性,7-AAD与RGD-IFP肽二聚体的计算机模拟对接理论模型显示,7-AAD与RGD-IFP中部结合的自由能和对接评分最低分别为:-12.16 kcal/mol和-8.37,显示此情况对接的构象最为稳定,它们可以通过静电作用、疏水效应和π-π堆积等非共价作用对接成稳定的有序三维空间结构。2.成功制备的RGD-IFP/7-AAD纳米颗粒,TEM和DLS形貌表征显示为分散均匀的直径92.5±26.7 nm似球状颗粒,Zeta电位为23.20±2.35 m V,成功自组装的RGD-IFP/7-AAD纳米颗粒有明显的荧光降低现象。XPS光谱显示自组装纳米颗粒主要由C、N、O组成,成分相对单一简单;圆二色光谱显示成功自组装的RGD-IFP/7-AAD肽构象发生改变;FTIR表征RGD-IFP/7-AAD分子间官能团的振动频率,显示有明显的配位作用。RGD-IFP衍生肽有助于疏水阳离子药物7-AAD的包封溶解,包封率与载药率最高可达76.26±6.7%和43.26±2.2%。体外p H7.4中性环境下,RGD-IFP/7-AAD纳米颗粒的粒径和Zeta电位在PBS缓冲液和10%FBS血清稀释液中长时间保持良好的稳定性。RGD-IFP/7-AAD纳米探针体外实验显示,其具有明显的酸敏特性,p H小于6.5时,纳米颗粒出现了不规则解离和明显的7-AAD药物释放。3.RGD-IFP/7-AAD纳米探针可以通过RGD靶向进入高表达αvβ3整合素的A549肿瘤细胞,并在细胞核位置呈现强烈的红色荧光。胞内摄取后可见RGD-IFP/7-AAD纳米探针与溶酶体的共定位,表明RGD-IFP/7-AAD可被溶酶体摄取并在酸性环境和溶酶体中释放7-AAD,使其能与胞内DNA发生结合。0.01μg/m L低剂量的RGD-IFP/7-AAD纳米探针24 h连续的作用已显示对肿瘤细胞活力的抑制;3 h的Ed U实验可见其明显的肿瘤细胞增殖抑制作用,它可能通过纳米颗粒释放的7-AAD插入细胞双链DNA中,将肿瘤细胞周期阻滞于G0/G1期。4.荷瘤小鼠体内活体成像结果显示,RGD-IFP/7-AAD纳米探针注射4 h及24 h在肿瘤部位均有较高的靶向滞留荧光成像能力;离体器官组织切片中显示RGD-IFP/7-AAD纳米探针与αvβ3整合素的靶向分布。持续的周期性给药后,RGD-IFP/7-AAD组显示出明显的抗肿瘤治疗作用;免疫组化染色反映RGD-IFP/7-AAD组Ki67阳性增殖的细胞显著降低（p<0.05）以及TUNEL阳性表达的显著上调（p<0.05）;H&E病理切片、血液生化和血常规结果表明,RGD-IFP/7-AAD的毒副作用较小且有良好的生物相容性。研究结论:设计并合成的RGD-IFP/7-AAD自组装纳米探针具有良好的细胞成像效果和肿瘤细胞生长抑制活性,并成功应用于人非小细胞肺癌裸鼠模型的肿瘤靶向荧光成像及治疗。因此,本研究为诊疗一体化双功能纳米探针的设计及应用提供了理论和实践依据。