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研究背景及目的急性主动脉夹层(Acute Aortic Dissection,AAD):为一种急危重大血管病变,主要是各种原因导致的动脉中层囊性变伴弹性纤维断裂、坏死,造成血管壁结构缺陷,血液随破裂内膜进入中层导致管壁分层,形成双腔主动脉,根据内膜破裂口是否累及升主动脉分为Stanford A和B型。A型AAD若48小时内未及时手术治疗,死亡率高达一半,病情极其凶险,若能早期准确诊断并分型,合理选择治疗方案,可有效改善预后。目前AAD主要依靠影像学检查确诊,但因其操作耗时、昂贵和需反复搬动患者,急诊条件下及基层医院有时无法进行,易延误最佳治疗时机,因此急需一种检测便易且能初期筛查的指标。微小RNA(microRNA,miRNA)是一种稳定存在于外周血的非编码小型调控核苷酸,是基因表达的重要转录因子和转录后抑制剂,参与多种疾病发病过程,可在外周检测,表达水平随疾病演变而变化。研究表明miRNAs也参与主动脉夹层的发病过程,本研究前期结果已经筛选出的miRNA-4787-5P和miRNA-4306对急性主动脉夹层早期诊断有较高的敏感度和特异度,可能成为早期诊断的潜在生物标志物,并预测和证实了两者的靶基因分别为PKD1和TGFβ1,很多研究显示它们均与主动脉夹层的发病机制有关,因此推测这两个miRNAs还可能参与了主动脉夹层发病机制。本实验在先前研究的基础上进一步筛选两种分型不同的AAD间表达量不同的miRNAs,探究miRNAs对AAD的分型是否有一定诊断价值,并分析其差异及意义。研究方法分别收集2016年10月~2017年11月就诊于郑州大学第一附属医院并明确诊断为AAD患者和正常对照者的外周血浆(所有入组者经医院伦理委员会批准后均签署知情同意书),并详细记录所有入组者入院即刻的基本生命体征(血压、心率、呼吸)和24h内的白细胞(white blood cell,WBC)、血小板(platelet,PLT)、D-二聚体、C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)、动脉粥样硬化情况、血脂情况、脑钠肽(brain natriuretic peptide,BNP)、升主动脉宽度等基本临床资料。将入组者分为三组:A组(急性Stanford A型)和B组(急性Stanford B型)和C组(正常对照组)。分别从三组血浆样本中选取6例,提取样本血中总RNA并行质量检测;应用安捷伦miRNA芯片分析miRNAs的表达谱,并筛出3组中显著表达差异的miRNAs,应用荧光定量-PCR技术对初筛结果表达显著差异的miRNAs(miRNA-146b、miRNA-29b和miRNA-21)分别在三组样本中进行验证,用受试者工作曲线(receiver operating characteristic,ROC)分析这三个差异表达miRNAs对AAD早期分型诊断的特异性及敏感性,最后通过生物信息学技术分析预测miRNA-146b、miRNA-29b和miRNA-21的下游靶基因,以分析急性Stanford A型和B型主动脉夹层间miRNAs的表达差异和意义。结果1.共收集急性主动脉夹层患者115例(包括Stanford A型51例和B型64例),其中A型女性10例,男性41例;B型女性13例,男性51例;正常对照组48例,男性39例,女性9例。A、B、C三组的性别、年龄、高血脂病史、饮酒史、吸烟史、RBC计数差异均无统计学差异(P均>0.05);A、B两组中动脉粥样硬化及高血压病例较C组明显升高,且B型夹层组合并动脉粥样硬化病例高于A和C组,A型夹层组合并高血压病史均明显高于B和C组,差异均具有统计学意义(P<0.05);A、B组升主动脉宽度较C组明显增宽,且A组升主动脉宽度较B组增宽,差异均具有统计学意义(P<0.05);A、B组D-二聚体值、BNP值、WBC计数较C组均明显升高,且A组中三者较B组也明显升高,差异均具有统计学意义(P<0.05)A、B两组CRP较C组明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05),而A、B两组间CRP无明显差异;A组CK-MB较B、C两组明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05),但B、C两组间CK-MB无明显差异;A、B两组HB较C组均降低,且A组下降更显著,差异均具有统计学意义(P<0.05);A、B两组PLT较C组降低,差异具有统计学意义(P<0.05),A、B两组间PLT无明显差异。2.采用基因芯片技术初步筛选出A和B两型夹层间共有22个表达差异的miRNAs,并选取其中表达显著差异的miRNA-146b、miRNA-29b和miRNA-21,经荧光定量PCR验证结果显示miRNA-146b在A、B、C三组中的相对表达量分别是0.78±0.61、1.19±0.98、0.47±0.44,与C组比较,A组和B组的表达量升高,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01),且A组与B组相比,B组的表达量升高的更明显,差异有统计学意义(P<0.05);miRNA-29b在A、B、C三组中的相对表达量分别是0.85±0.67、0.37±0.29、0.56±0.45,与C组相比,A组的表达量明显升高,而B组的表达量明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01);miRNA-21在A、B、C三组中的相对表达量分别是0.36±0.28、1.02±0.77、0.68±0.58,与C组相比,A组的表达量明显降低,而B组的表达量明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01);均符合基因芯片初步筛查结果。ROC曲线下面积示miRNA-146b在A、B两组中的曲线下面积分别是:0.653和0.607,miRNA-29b在A、B两组中的曲线下面积分别是:0.632和0.364,miRNA-21在A、B两组中的曲线下面积分别是:0.301和0.661,根据结果显示miRNA-29b、miRNA-21对夹层的分型诊断敏感度和特异度均较低,尚未达到诊断标准;miRNA-146b曲线下面积大于0.5,具有一定诊断分型价值。3.应用生物信息学分析软件预测miRNA-146b的下游靶基因为:TRAF6、κB1、ACTA2、MMP16;miRNA-29b的下游靶基因为:TGF-β、Elastin(ELN)、MMP2、MMP9、COL1A1、COL2A1、COL3A1、COL5A1;miRNA-21的下游靶基因为:PTEN。结论1.血浆中miRNA-146b、miRNA-29b和miRNA-21在急性Stanford A型和B型主动脉夹层之间表达存在显著差异。2.血浆miRNA-146b对急性主动脉夹层的分型有一定诊断价值,可能成为其诊断分型的潜在生物标志物之一,而miRNA-29b、miRNA-21在急性Stanford A、B两型夹层中的差异表达尚未达到诊断学意义,两者是否能作为AAD诊断分型的标志物仍需进一步研究。3.初步预测出miRNA-146b、miRNA-29b和miRNA-21的下游靶基因,并分析推测出三者在急性Stanford A、B两型夹层中的差异表达与急性主动脉夹层的发病机制和预后相关。