论文部分内容阅读
完全解析褪黑素促进山羊绒生长的机制仍然是一个挑战。为了研究转录水平绒山羊皮肤中哪些mRNA和长非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)被外源褪黑素招募在非生绒期促羊绒生长,及转录后水平哪些mRNA和lncRNA发生可变剪接(Alternative splicing,AS)参与调控山羊绒生长,选取6只罕山白绒山羊随机分为对照组和褪黑素埋植组,每组设3个重复,以自然年为试验周期,每月采集皮肤样本进行RNA测序(RNA Sequencing,RNA-Seq)。1.使用Bowtie、Top Hat、Cufflinks、Cuffmerge、Cuffdiff、Cuffcompare、CPAT和CPC软件分析RNA-Seq数据,得到2024个差异表达mRNA(differentially expressed mRNA,DE-mRNA);得到329个差异表达新lncRNA(differentially expressed lncRNA,DE-lncRNA),发现已知转录本潜在亚型lncRNA和基因间lncRNA的数量较多,其他类型lncRNA数量较少。2.主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)发现2024个DE-mRNA和329个DE-lncRNA应答了绒山羊皮肤次级毛囊生长周期。3.使用加权基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis,WGCNA)方法挖掘调控山羊绒生长的基因模块,联合生物信息学的多种分析方法进一步确定调控山羊绒生长的候选基因集。(1)构建了正常生理状态下和外源褪黑素诱导下绒山羊皮肤组组织中2024个DE-mRNA和329个DE-lncRNA的加权基因共表达网络,将对照组降维为8个基因模块,将埋植组降维为10个基因模块,发现了Hippo目标基因模块。(2)量化了模块间的互作关系,定量了模块与样本的关联,发现对照组Hippo基因模块与皮肤次级毛囊生长期(8~12月)的样本正相关,埋植组Hippo模块的基因与氧化磷酸化模块和细胞周期模块的基因协同互作与两次产绒期(4~7月及8~12月)的样本正相关,揭示了对照组和埋植组调控山羊绒生长基因模块所参与的45个及44个GO条目或KEGG通路按时间进程协调互作的内在关系。(3)揭示了正常生理状态下和外源褪黑素诱导下调控山羊绒生长候选基因集159个mRNA和24个lncRNA及191个mRNA和49个lncRNA的共表达调控网络关系,对照组和埋植组候选基因集分别在正常产绒期8~12月及两次产绒期4~7月和8~12月高表达,对照组和埋植组候选基因集共有的注释到Hippo信号通路的11个基因、皮肤发育的8个基因、细胞周期的9个基因、中间纤维的11个基因、氧化磷酸化的4个基因及与上述43个基因强相关的14个lncRNA在产绒期高表达。4.从基因集富集分析(Gene set enrichment analysis,GSEA)、基因集变异分析(Gene Set Variation Analysis,GSVA)、定量候选基因集与山羊绒生长周期的关联三个不同角度透视了候选基因集调控山羊绒生长的生物学功能,鉴定了候选基因集的64个核心基因,22个转录因子(transcription factors,TF)和11个转录辅因子(transcription cofactors,TF co)。5.使用rMATS软件识别了绒山羊皮肤转录组mRNA差异可变剪接事件(differential alternative splicing events,DASE)总计715,SE和MXE为最主要的AS方式;识别了lncRNA的DASE总计569,SE和RI为最普遍的AS方式。(1)发现正常生理状态下绒山羊皮肤毛囊发育不同阶段之间的剪接百分比(Percent spliced-in,PSI)水平呈显著正相关;外源褪黑素诱导下两次产绒期之间的PSI水平呈显著正相关。外源褪黑素诱导增大了DE-mRNA发生AS的机率。(2)2024个DE-mRNA中有67个发生了DASE,329个DE-lncRNA中有7个发生了DASE,这74个DAS_转录本在对照组Hippo目标基因模块分布最多,在埋植组细胞周期目标基因模块分布较多。(3)构建了正常生理状态下绒山羊皮肤中由220个mRNA和63个lncRNA组成的AS调控网络,其中的DAS_转录本与调控绒生长候选基因集中的35个mRNA和18个lncRNA存在互作;构建了外源褪黑素诱导下绒山羊皮肤中由207个mRNA和41个lncRNA组成的AS调控网络,其中的DAS_转录本与调控绒生长候选基因集中的24个mRNA和5个lncRNA存在互作。(4)AS调控网络主要参与对白细胞介素4的细胞应答,细胞分化的正调控、ECM-受体相互作用,PI3K-Akt信号通路,c GMP-PKG信号通路,皮质醇的合成和分泌,黑色素生成等生物学过程。本研究在组学水平从基因集角度解析了调控山羊绒生长的mRNA、lncRNA和TF的共表达调控关系,注释了绒山羊皮肤中59个lncRNA的生物学功能,丰富了我们对促山羊绒生长mRNA、lncRNA和TF的认识,为注释家畜lncRNA提供了新思路。确定了调控山羊绒生长的关键通路Hippo信号通路,为进一步研究外源褪黑素促山羊绒生长的机制提供了参考。识别了绒山羊皮肤毛囊发育过程中mRNA和lncRNA的可变剪接,构建了发生可变剪接的mRNA和lncRNA在绒山羊皮肤转录组中的潜在相互作用网络,为AS调节对褪黑素促山羊绒生长的影响提供新的潜在见解。