小麦TaGAPC1基因及启动子的克隆与功能分析

来源 :西北农林科技大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jiaojiao2008zwj
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甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)是糖酵解途径中的关键酶,作为GAPDH蛋白的胞质亚型,GAPC催化3-磷酸甘油醛氧化生成1,3-二磷酸甘油酸,但其在应答非生物胁迫中的作用研究的比较少。在本研究中我们使用RACE技术从小麦中克隆出TaGAPC1基因,并对其进行了基因结构分析和系统发育分析。通过构建TaGAPC1融合GFP报告基因的表达载体,使用基因枪法对TaGAPC1蛋白进行了亚细胞定位。通过实时荧光定量PCR技术,分析了TaGAPC1基因在不同非生物胁迫下和不同组织中的表达模式。此外,还从小麦中扩增出了TaGAPC1基因的启动子序列,构建了其融合GUS报告基因的植物表达载体并转化烟草植株,进行GUS染色以验证TaGAPC1启动子的活性。并对TaGAPC1启动子进行了5’端缺失分析,测定在PEG8000、Na Cl、4℃和ABA四种胁迫下,各个启动子片段驱动的GUS酶活,以确定特定非生物胁迫下关键的启动子功能区域。实验结果如下:1.使用RACE技术从小麦中克隆出TaGAPC1基因全长,基因结构分析表明其包含1014 bp的ORF序列、93 bp的5’UTR序列和219 bp的3’UTR序列,且基因由12个外显子和11个内含子组成,系统发育分析表明TaGAPC1蛋白与大麦Hv GAPC1蛋白(Genbank No.P26517)具有最高的序列同源性。2.通过构建TaGAPC1基因融合GFP的表达载体,并使用基因枪法将重组载体转化进入洋葱表皮细胞,共聚焦显微镜观察结果表明TaGAPC1蛋白定位于细胞质中。3.TaGAPC1基因诱导表达谱说明该基因能够被PEG8000、Na Cl和ABA胁迫显著诱导,但对于4℃的响应并不明显;TaGAPC1基因组织表达谱说明其在叶片中的表达量最高,根中的表达量次之,茎中的表达量最低。4.将克隆得到的TaGAPC1基因融合GUS植物表达载体,并瞬时转化烟草植株,通过GUS染色发现,TaGAPC1启动子能够驱动下游报告基因的表达,具有启动子活性。5.对TaGAPC1启动子进行5’端缺失实验,扩增得到5个启动子缺失片段,构建其融合GUS的植物表达载体,转化烟草植株后,测定在PEG8000、Na Cl、4℃和ABA四种非生物胁迫下,各个启动子片段驱动下的GUS酶活。结果表明-973 bp~-605 bp启动子区域中干旱应答元件如DRE和MBS对应答PEG8000和Na Cl胁迫至关重要;-973 bp~-475 bp启动子区域中的ABA应答元件ABRE对应答ABA胁迫很关键。
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