论文部分内容阅读
本研究从低温（1℃）贮藏1～2周的马铃薯栽培品种“甘农薯1号”块茎中提取总RNA，利用RT-RNase和Oligo（dT）15合成cDNA第一链。根据已知的AcInv酶基因碱基序列合成特异引物，PCR扩增得到了1.92kb的特异片段克隆。将其与pGEM-T Easy Vectorl连接，转化E.coli DH5α，得到重组子pGEMA；经酶切和序列分析鉴定，该片段含有1917bp ORF，编码639个氨基酸残基，与国外报道序列相符；用BamHⅠ和SacⅠ从pGEMA上切下目的片段，用同样的双酶切切除pBI121上的GUS基因，然后将目的片段反向插入到pBI121的BamHⅠ和SacⅠ酶切位点之间，构建出了AcInv酶基因反义植物表达载体pBIRA；采用DNA直接导入法已将反义植物表达载体质粒pBIRA导入农杆菌LBA4404得到了工程菌。 在遗传转化过程中，先对受体再生系统建立进行了研究。选用试管苗茎段、叶片、试管薯（microtuber）薄片、微型薯（minituber）薄片和大田薯块（tuber）薄片等五种外植体材料，以MS为培养基基本成分，对生长激素的浓度和配比进行优化组合，筛选出有利于受体材料高效再生的培养基配方。最终确定出的有利于茎段愈伤诱导的培养基为：1/2MS+0.2mg/LNAA+1.125mg/L 6-BA，两种激素摩尔浓度比为1∶5；有利于根分化的培养基为：1/2MS+0.4mg/L NAA；有利于芽分化的培养基为：1/2MS+3.4mg/L 6-BA+4.5mg/L GA3，两种激素摩尔浓度比为1∶1.2。对于叶盘培养来讲，有利于愈伤诱导的培养基中NAA和6-BA绝对加入量和摩尔浓度比均高于茎段愈伤诱导；其根分化培养基成分与茎段愈伤根分化培养基相同。在1/2MS+4mg/L IAA+4mg/L Zea+4mg/L KT+0.5mg/L叶酸+0.05mg/L生物素+1.0mg/L 2，4-D+0.1％水解酪蛋白+3％蔗糖的培养基对薯片培养和愈伤诱导效果良好。 通过Kan敏感性试验，确定了马铃薯试管苗茎段、叶盘和各种薯片筛选的Kan使用浓度。一般使用75mg/L Kan的选择压即可有效的防止试管苗茎段和各种薯片假转化体的出现；而试管苗叶盘的Kan选择压较低，以25mg/L较为适宜。在转化苗生根诱导培养中，使用50mg/LKan进行选择比较适合。 针对马铃薯受体材料特别是薯片转化培养过程中易发生褐化的问题，对如何防止褐化的技术进行了研究。褐化速度和程度与取材发育程度有关，取自大田薯块的薯片最易褐化，微型薯薯片、试管薯薯片和试管苗叶盘次之，茎段最轻。在光照培养条件下，薯片既使在培养基中加入2％的PVP也无济于事。受体材料一旦褐化，基本上丧失再生能力。经过反复摸索发现，在受体材料初期培养阶段（接种后7～9天内，包括了预培养、共培养和选择培养初期阶段）置于暗处能有效的防止褐化，如果加入2％PVP或水解酪蛋白则效果更好。 通过预培养时间、农杆菌浓度、浸染时间、共培养时间和诱导剂等对转化的影响研究，建立和优化了转化体系。总体来讲，茎段预培养2天，叶盘和薯片预培养3天转化效率最高，抗性愈伤诱导率达到48％、43.6％和35.2％。农杆菌浓度在0.D.600为0.2和0.5时，外植体均能正常形成愈伤组织，但以0.D.600为0.5的浓度比较适宜。从浸染时间对转化的影响来看，茎段侵染10min，叶盘5min效果较好。由于薯片创伤面较大，粘着的菌量也较多，所以要严格控制浸染时间，以浸染3min为好，千万不可延长时间，否则会因带菌量过多而危害加重，发生极度褐化，致使转化失败。共培养时间以茎段2天、叶盘3天、薯片1天效果最好。诱导剂乙酰丁酰酮（AS）对农杆菌浸染马铃薯各类受体材料有明显的促进作用；在使用AS的同时，配合使用1μmol/L的脯氨酸（Pro）效果更好。因AS价格较贵，而转化苗的获得效率很低，需要做大量的转化培养，AS的耗量较大。所以，对AS的使用方法进行了改进，方法是将AS涂布到共培养的培养基表面。这一改进要比直接将AS加入培养基中更好，可节省90％的AS用量。 我们对硝酸银在转化受体出愈和芽分化中的作用进行了研究，结果硝酸银对叶盘产生任何促进作用，相反加剧了褐化程度；但可提高转化薯片的愈伤诱导，在含10mg/L AgNO3的培养基上，转化薯片也可直接分化出芽。 从不同受体材料的转化效果来看，试管苗茎段是遗传转化的较好材料，具有愈伤诱导率高，分化再生能力强，褐化程度轻，取材方便的突出优点；其次是薯片；而试管苗叶盘转化效果最差。对国内外七个加工型品种进行了转化研究，结果显示农杆茵对马铃薯基因型存在依赖性，“大西洋（AtaboC）”、“夏伯蒂（shapedy）”“布尔班克（Russet Burbank）”和“甘农薯二号”等四个品种分化再生能力较强，其中大西洋、布尔班克的转化效率较高，分别达到4％和3．l％，目前已从这四个品种上获得转化苗共23株。经PCR检测，大部分转化植株扩增产生了1．92kb的目的片段，初步表明外源反义Aclnv基因己导入受体基因组中。将PCR检测分析为阳性的植株进行Southern杂交，结果显示外源反义Aclnv基因已确实导入受体基因组中。目前这些转化植株均已生根，并移栽成活。