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乳源性活性肽是指乳蛋白经不完全水解产生的具有其前体所没有的特殊生理功能的肽类。它们具有调节人体生理机能和防病治病的功效,如抗菌、抗高血压、抗凝血、降胆固醇、免疫调节等,在食品与药品行业中应用广泛,具有很好的发展前景。目前乳源性肽主要通过酶法获得,但是由于酶的专一性强,使肽的种类和功能受到限制。而采用微生物发酵法制备乳源性活性肽,由于微生物酶系庞大并且种类多,可直接降解蛋白质产生比较多的肽源,从中获得有益活性肽的可能性较大,为进一步研制更多种类和功能的多肽奠定基础。
本实验利用具有庞大蛋白酶系的米曲霉作为菌种,以牛乳为原料,进行了米曲霉发酵牛乳产多肽的研究。通过单因素实验和正交试验,确定米曲霉在牛乳中最适培养条件。在最适培养条件下,利用米曲霉水解牛乳,最终确定产多肽的较佳条件,并对所产多肽进行了粗提和抑菌性实验研究。主要结论如下:
首先用牛乳培养米曲霉,考察温度26℃~32℃、接种量3%~7%、装液量20mL~50mL、转速120r/min~200r/min,通过单因素实验和正交试验确定米曲霉发酵牛乳的最佳培养条件为:温度28℃、接种量7%、装液量30mL/250mL、转速180r/min、培养72h,在此培养条件下,米曲霉的菌丝干重可达2.61g/100mL。
其次进行米曲霉水解牛乳蛋白产多肽的条件研究。①采用未经处理的米曲霉酶液水解乳蛋白:考察加酶量3%~8%、水解温度40℃~55℃、水解时间5h~60h;②采用超声波破壁法制备酶液水解乳蛋白:考察超声温度30℃~50℃、超声功率100W~250W、超声时间5min~25min、加酶量3%~7%;③采用高压匀质机破壁法制备酶液水解乳蛋白:考察压强50MPa~150MPa、循环次数2次~4次、加酶量2%~6%、水解时间5h~45h;④采用渗透剂NaCl法制备酶液水解乳蛋白:考察NaCl浓度0.05mol/L~0.25mol/L、加酶量3%~7%、水解时间5h~50h。比较经四种方法处理后的酶液水解乳蛋白所得水解液中肽含量,通过单因素和正交试验确定最佳米曲霉酶液水解乳蛋白产肽条件。结果表明:采用高压匀质机破壁法,压强75MPa、循环次数4次、加酶量5%、水解32h制得酶液水解乳蛋白所得肽含量最高,可达2.41mg/mL。
最后采用透析法对最佳条件下得到的水解液中的多肽进行粗提,用截留分子量为3500Da和1000Da的透析袋进行分级透析,考察不同分子量段的粗提肽对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果。结果表明:分子量在1000Da~3500Da的粗提肽,对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌直径分别为15.21mm和14.14mm,分子量小于1000Da的粗提肽,对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌直径分别为17.85mm和16.24mm。
通过米曲霉水解牛乳实验可看出有大量的肽产生,并对肽的抑菌活性进行初步研究,为研究新的种类和功能性肽提供了一定的实验依据,具有一定的科学性和应用价值。