目的利用Wistar幼鼠、成年鼠和人胚胎软骨细胞观察脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)对动物关节软骨的损伤,观察DON对NO、基质金属蛋白酶等细胞因子的影响以及对关节软骨胶原合成和分解代谢的影响,探讨DON与大骨节病发病关系和致病机理,为大骨节病的防治提供科学依据。方法1.动物实验,复制大骨节病动物模型,采用灌胃方式投与不同浓度DON毒素,染毒时间为80天,观察DON致动物关节软骨病理损伤及其机制。1.1通过HE染色和投射电子显微镜,观察DON导致动物关节发育和钙化异常的形态学改变。1.2通过免疫组织化学,检测不同浓度DON处理对动物关节软骨表达MMPs、iNOS、COL2的影响。2.体外软骨细胞培养:培养人胚胎软骨细胞,用不同浓度的DON毒素处理软骨细胞而后分别观察以上指标。2.1 ELISA法检测培养上清MMP-13,硝酸还原酶法检测上清液的NO的含量。2.2流式细胞术(FCM)检测软骨细胞早期凋亡情况及一氧化氮合酶和Ⅱ型胶原表达的情况。2.3采用RT-PCR法测定Ⅱ型胶原mRNA和iNOS mRNA的表达。结果1. HE染色和投射电子显微镜结果显示:对照组关节软骨基质较均匀、致密,骺板软骨从骨骺到干骺端结构完好,软骨基质呈弱嗜酸性,细胞排列保持良好的层次;实验组幼鼠可见软骨细胞变性,坏死,排列紊乱。健康细胞与受损细胞交互排列,呈现DLD现象。骨小梁数目减少,且骨小梁变细、连接中断,立体网状结构破坏;成年鼠可见软骨细胞变性坏死,有的细胞核溶解消失。电镜可见基质内有较小的、大小均匀的、电子密度高的颗粒状物质,线粒体肿胀和固缩兼有,并见大小不等的空泡,脊破坏或消失。细胞核形态不规则、固缩,染色质边聚,关节软骨胶原网络结构破坏。2.免疫组织化学结果显示:(1)Ⅱ型胶原表达量为对照组(7.42±1.12)%,低剂量组(4.79±0.96)%,高剂量组(2.82±0.68)%,差异有统计学意义(P<0.05),高剂量组显著低于对照组(LSD检验的t和P值分别为t= 9.810,P=0.000);(2) iNOS表达量为对照组(6.90±1.61)%,低剂量组(8.52±1.90)%,高剂量组(11.78±2.51)%,且随DON浓度增高而增加(P<0.05);高剂量组明显高于对照组和低剂量组,差异有统计学意义(P<0.05);(3) MMP-13表达量为对照组(3.06±1.13)%,低剂量组(6.45±1.56)%,高剂量组(12.47±2.45)%,差异有统计学意义,且随DON浓度增高而增加(P<0.05)。3. FCM、RT-PCR、ELISA结果显示:(1)DON组早期凋亡率为6.78%～19.05%,高于对照组1.20%,凋亡率随DON浓度增高而增加(P<0.05)。(2)DON组上清液NO含量为20.8μmol/L～40.7μmol/L,高于对照组10.2μmol/L(P<0.05);MMP-13含量为0.25μmol/L～0.56μmol/L,高于对照组0μmol/L(P<0.05)。(3)DON组软骨细胞iNOS表达强度为14.8%～56.8%,高于对照组7.1%(P<0.05)。高剂量DON组(0.4μg/ml和1.0μg/ml)Ⅱ型胶原表达强度为56.7%和52.7%,低于对照组62.2%(P<0.05)。(4)DON组软骨细胞内iNOS mRNA表达比值为1.07～1.33,高于对照组0.62(P<0.05)。高剂量DON组(0.4μg/ml和1.0μg/ml)软骨细胞内Ⅱ型胶原mRNA表达比值为0.83和0.84,低于对照组1.14(P<0.05)。结论1. DON可致Wistar大鼠骨和软骨损伤,其损伤结局与骨的生长发育阶段密切相关:在干骺闭合前,除可致软骨损伤,而且还可致成骨化骨过程发生障碍,在损伤、修复、再损伤、再修复的病理过程中,最终导致干骺早闭,然后导致大骨节样病变,发生肢体短小;在干骺闭合后,可导致软骨细胞坏死、胶原破坏,最终表现为骨关节炎样改变。2. DON可增加软骨细胞iNOS的表达,提高NO的合成,NO可进一步促进MMP-13的合成并增加Collagen typeⅡ的降解,进而导致软骨的损伤。3. DON可能与大骨节病、骨关节炎的发生发展有关,与负荷、外伤等共同作用成为骨关节病的病因。