论文部分内容阅读
冬虫夏草（Ophiocordyceps sinensis）是我国的一种传统名贵中药材,由冬虫夏草菌（Ophiocordyceps sinensis）寄生在蝙蝠蛾科幼虫而形成的僵虫与子座的虫菌复合体。主要分布于我国的青海、西藏、甘肃、四川、云南等省区,北起祁连山一带,南至滇西北高山,东到川西高原山地,西达喜马拉雅山的大部分地区。冬虫夏草菌的无性型是中国被毛孢（Hirsutella sinensis）,但冬虫夏草周围还存在着许多其他伴生菌或共生真菌,是一类很重要的真菌资源。这些真菌中的某些种类具有与野生冬虫夏草类似的化学成分和药理活性,并己被开发利用。因此,冬虫夏草周围存在一个复杂的微生物区系。冬虫夏草微生物区系中的真菌可能与冬虫夏草菌协同作用才形成冬虫夏草,因此对冬虫夏草真菌群落多样性进行全面认识是非常有必要。本文对冬虫夏草微生物区系中的真菌进行多样性分析,以期全面了解存在于其中的真菌类群。冬虫夏草主要生长在海拔约35005000 m的高山灌丛和草甸中,尤其常见于积雪、排水良好的高寒草甸。高寒草甸特殊环境是一个微生物资源宝库,其微生物具有种质资源的新颖性和多样性。由于其特殊的环境特征,有可能从生存于其中的微生物中发现结构新颖的生物活性物质。对高寒草甸微生物次生代谢生物合成的有关功能基因进行研究,可为从生物合成途径深入研究其次级代谢产物提供分子生物学的证据,并为今后其开发利用微生物次级代谢产物的生物合成提供基因资源。主要研究结果如下:1、通过高通量测序对野生冬虫夏草周围土壤和菌膜部位真菌多样性进行研究,结果表明,土壤真菌多样性与菌膜相比具有明显差异。土壤和菌膜部位共检测到5个真菌门、15个纲、41个目、79个科、112个属。土壤部位共检测到66个已知属真菌类群,主要以丝盖伞属（Inocybe）、Archaeorhizomyces、棉革菌属（Tomentella）和革菌属（Thelephora）为优势菌属,所占种群数量的比例分别为53.32%、8.69%、8.12%和7.21%。菌膜部位共检测到43个已知属真菌类群,主要以蛇形虫草属（Ophiocordyceps）和蜡壳菌属（Sebacina）为优势菌属,所占种群数量的比例分别为95.86%和1.14%。此外,土壤和菌膜部位共有34个菌属是共同存在,32个菌属为土壤部位特有,9个菌属为菌膜部位特有。2、通过对冬虫夏草微生态区系中真菌进行分离,得到77株真菌菌株。选取不同形态的菌株进行ITS（internal transcribed spacer）基因扩增、测序以及序列分析,结果显示,冬虫夏草微生态区系分离获得的真菌分属于2个门、4个纲、9个目、21个科、33个属。包括:蛇形虫草属（Ophiocordyceps）、木霉属（Trichoderma）、壳囊孢属（Cytospora）、截盘多毛孢属（Truncatella）、Dactylonectria、棒束孢属（Isaria）、头孢霉属（Cephalosporium）、镰刀菌属（Fusarium）、赤壳属（Cosmospora）、拟青霉属（Paecilomyces）、弯颈霉属（Tolypocladium）、Cercophora、白僵菌属（Beauveria）、新丛赤壳属（Neonectria）、Microdochium、锥毛壳属（Coniochaeta）、蜡蚧菌属（Lecanicillium）、土赤壳属（Ilyonectria）、Stagonosporopsis、枝孢属（Cladosporiu）、Pleotrichocladium、小球腔菌（Leptosphaeri）、Chaetosphaeronema、Paraphaeosphaeria、光黑壳属（Preussia）、Neosetophoma、Leptodontidium、Chalara、假裸囊菌属（Pseudogymnoascus）、地丝霉属（Geomyces）、Tetracladium、毛霉属（Mucor）、被孢霉属（Mortierella）。其中,被孢霉属（Mortierella）和木霉属（Trichoderma）为优势种群,分别占菌株总数的21.33%和10.67%。3、分别利用简并引物PKS（KAF1/KAR2）和NRPS（AUG003/AUG006）对77株菌株进行了聚酮合成酶（Polyketide synthase,PKS）和非核糖体多肽合成酶（Non-ribosomal peptide synthetase,NRPS）基因的扩增。研究结果表明,77株菌株中,从15株菌株中扩增到PKS基因KS结构域片段,阳性率为19.48%;从31株菌株中扩增到NRPS基因A结构域片段,阳性率为40.26%;菌株Fusarium verticillioides（JM22）、Hypocrea pachybasioides（JM112）和Helotiales sp.（JM125）均成功扩增出2条PKS基因片段;菌株Trichoderma paraviridescens（JM31）、Trichoderma polysporum（JM100）、Hypocrea pachybasioides（JM112）、Leptosphaeria sclerotioides（TY110）、Trichoderma polysporum（TY128）、Pseudogymnoascus sp.（TY165）、Paecilomyces hepiali（TY187）和Ophiocordyceps sinensis（ZG1）同时扩增到了PKS和NRPS基因,值得进一步深入研究。