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目的:研究人C2H2型锌指转录因子新基因ZNF580过表达对内皮细胞基因表达谱的影响,为阐明ZNF580基因的功能提供新的实验依据。
方法:
1人脐静脉内皮细胞株EA.hy926,用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基在37℃、5％CO2、饱和湿度下培养,至EA.hy926细胞生长成单层后备用。
2采用脂质体法将真核表达载体pEGFP-ZNF580和pEGFP-C1导入EA.hy926内皮细胞,用含400μg/mlG418的完全培养基筛选并建立稳定的转染细胞株EA.hy926pEGFP-ZNF580和EA.hy926pEGFP-C1,扩大培养后用RT-PCR和Western Blot方法鉴定ZNF580基因的表达。
3利用MTT比色法分析ZNF580对内皮细胞增殖活性的影响。
4应用基因芯片分析EA.hy926pEGFP-ZNF580和EA.hy926pEGFP-C1细胞株的基因表达谱,并通过Real Time-PCR方法验证19个差异基因。
5生物信息学分析芯片结果,MEME算法对差异基因启动子区域中的一致性序列进行计算;差异基因构建信号通路图。
结果:
1在荧光显微镜下可见,EA.hy926pEGFP-C1细胞,绿色荧光蛋白布满内皮细胞整个胞浆,而EA.hy926pEGFP-ZNF580细胞,融合有绿色荧光蛋白的ZNF580蛋白聚集于内皮细胞核中。经RT-PCR和Western Blot方法鉴定,通过转染内皮细胞,筛选获得稳定细胞株EA.hy926pEGFP-ZNF58和EA.hy926pEGFP-C1。
2基因芯片筛选差异表达基因发现上调的基因有78个包括转化生长因子β1(TGFβ1)、转化生长因子β2(TGFβ2)、成纤维生长因子1(FGF1)、成纤维生长因子(FGF2)、白介素8(IL8)、锌指基因480(ZNF480),下调的基因有66个,包括集落刺激因子2(CSF2)、乙酰辅酶A乙酰转移酶2(ACAT2)、SMAD1、基质金属蛋白酶10(MMP10)、ATP结合盒8(ABCA8)、Krüppel因子9(KLF9)、磷酸二酯酶3A(PDE3A)等。差异表达基因的功能涉及内皮细胞许多方面,包括细胞周期调控基因,信号转导相关基因,与血管生成和重塑相关基因,转录活性调控基因及翻译活性调控基因等。
3 EA.hy926pEGFP-ZNF580细胞增殖活性显著高于EA.hy926 pEGFP-C1细胞。
4 MEME法预测出ZNF580所结合的九个碱基的一致性序列为CCAG[G/C]CTGG,该序列的E-value值最小,为1.1e-531。生物信息学分析,ZNF580在EA.hy926细胞株中,参与细胞周期和血管生成的调节方面,发挥了重要作用。
结论:
1成功建立ZNF580基因稳定转染细胞株EA.hy926 pEGFP-ZNF580和对照株EA.hy926pEGFP-C1。
2应用基因芯片技术分析EA.hy926pEGFP-ZNF580和EA.hy926pEGFP-C1细胞株的差异表达基因,从芯片结果挑选10个上调表达和9个下调表达基因用Real Time-PCR方法进行验证,结果提示基因芯片结果假阳性率低,可信度高。
3 ZNF580基因转染内皮细胞EA.hy926后引起EA.hy926细胞基因表达谱广泛改变。
4 ZNF580可以促进内皮细胞EA.hy926增殖。
5对差异基因的分析发现ZNF580基因引起EA.hy926细胞基因表达谱中细胞周期调节通路上分子的改变,ZNF580基因可能通过调节这些重要的信号转导通路而调节内皮细胞的生物学功能。