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多糖的生物活性、化学结构以及构效关系的研究已成为多糖领域的前沿阵地,并且取得了很大的进展。其中,关于一些相对分子量在几千以上、强生物活性多糖的研究日益受到重视。本文以我国自主知识产权的海洋多糖药物藻酸双酯钠(PSS)作为研究对象,采用超滤及低压柱层析方法对其分级制备,分离得到具有相似骨架、磺化度及不同相对分子量(Mw)的分级产物;通过对各分级产物进行抗凝血活性、免疫调解作用、保护神经元细胞凋亡、抗菌、降糖等生物活性的考察,探讨PSS的链长与活性的关系,为PSS的广泛应用及多糖构效关系的深入研究进行有益的探索。研究结果如下:1、低压柱层析法以Sephadex G100作为分离介质,对PSS(Mw:17.19 kDa)进行分离,高效凝胶渗透色谱法测定产物重均分子量(Mw),得到Mw分别为51.95,25.62,11.76,5.41 kDa 4个分级产物(Z-PSS:1-4);以截留分子量分别为30,10,5,3,1 kDa的超滤膜分级PSS,得到Mw分别为21.97,20.25,18.27,11.35,4.93,3.33 kDa 6个分级产物(C-PSS:1-6)。氧瓶燃烧法(Oxygen Flask Method)测定所有分级产物磺化度多在1.2-1.3之间;红外光谱(FT-IR)、核磁共振碳谱(13C-NMR)证明分级产物磺化取代发生在糖环的C-2,C-3,酯化取代发生在C-6。2、分级产物生物活性比较研究:2.1、PSS及柱层析分级产物Z-PSS:1-4抗凝血实验(凝血三项:凝血酶原时间PT,活化部分凝血活酶时间APTT,凝血酶时间TT)显示:PSS及4个分级产物延长TT时间作用最强,其次为APTT,延长PT时间作用最弱,以上结果通过与对照组比较,t-test,显示统计学差异(p<0.05)。4个分级产物抗凝活性比较显示,抗凝血作用与分子量显著相关,不同的凝血指标对分子量的要求显著不同,APTT显著随PSS分级产物分子量的降低而降低。2.2、PSS及超滤分级产物C-PSS:1-5抗凝血实验(PT,APTT,TT)进一步证实了柱层析分级产物凝血三项实验结果:样品对TT作用最强,APTT次之,对PT作用较弱,而且活性大小与样品的分子量显著相关。2.3、在凝血三项实验的基础上,进一步验证了PSS及柱层析分级产物Z-PSS:1-4对凝血因子FIIa和FXa的作用。结果显示PSS主要通过作用于FIIa因子发挥抗凝血作用,强度与低分子肝素类似;对FXa作用较弱。各分级产物抗凝血因子作用比较显示,作用强度与分子量显著相关,随着分级产物Z-PSS1→4分子量的降低,抗凝血因子作用显著降低,Z-PSS4失去抗FXa作用。2.4、抗蜂毒肽(Mastoparan)诱导的大鼠原代神经元细胞凋亡实验结果显示:PSS对Mastoparan诱导的大鼠子鼠原代神经元细胞凋亡有显著的保护作用,其分级产物Z-PSS1-3也表现出对凋亡神经元细胞的保护作用,而Z-PSS4没有这种作用,证明该作用有最低糖链片断要求,但并不会随糖链长度的延长而保护作用增强。采用Fluo-3/AM荧光探针技术标记胞内钙离子,测定胞内钙离子浓度变化,推测PSS保护神经元细胞的凋亡作用机制是抑制胞内钙释放。2.5、本课题对PSS及Z-PSS1-4的免疫调节作用进行了细胞水平的研究。主要考察样品对小鼠脾脏细胞、小鼠腹腔巨噬细胞、刀豆蛋白A(Concanavalin A,Con A)诱导的免疫T-Cell、脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的B-Cell的作用,探讨PSS及分级产物的免疫调节作用。实验结果显示,PSS能增强脾脏细胞的增殖作用,抑制Con A诱导的T-Cell和LPS诱导的B-Cell增殖,同时能够促进巨噬细胞的吞噬功能。对于脾脏细胞的作用,PSS分子量在10-20 kDa之间较显著;对于促进巨噬细胞吞噬功能,显示PSS分子量最大分级产物作用最强。2.6、以革兰氏阳性菌-金黄色葡萄球菌、革兰氏阴性菌-大肠杆菌作为目标菌株,检验PSS及其层析产物Z-PSS:1-4,C-PSS1-5的抑菌作用。结果显示:PSS及Z-PSS:1-3,C-PSS1-4对金黄色葡萄球菌有良好的抑制效果,且Z-PSS2-3,C-PSS4效果强于Z-PSS1,C-PSS1-3,证明分子量较小PSS片断具有较强的抑菌作用;同时Z-PSS4及C-PSS5失去抑菌作用,显示PSS抑菌活性与糖链长度的关系。2.7、在胰岛细胞筛选PSS超滤分级产物促进胰岛素分泌作用的基础上,进行C-PSS4的降低四氧嘧啶高血糖小鼠血糖作用研究。结果显示:C-PSS4有降低高血糖小鼠血糖的趋势,但未见统计学差异(p>0.05)。鉴于细胞水平研究的结果,整体药效学实验有待于进一步研究。