雄黄入药始载于《神农本草经》,具有解毒杀虫,燥湿祛痰,截疟的功效,在我国的临床使用己有几千年的历史。从20世纪50年代以来,就有国内医者将含雄黄的复方制剂或单方用于医治血液系统疾病、恶性淋巴系统疾病乃至实体瘤,取得了显著的治疗效果。但是由于具有毒性,故雄黄及其含有雄黄的成方制剂的安全使用就显得至关重要。雄黄的毒性不仅和雄黄中砷的总量有关,还和砷的化学形态及其代谢产物密切相关。不同价态,不同化学形式的砷化合物,其毒性可相差成千上万倍。肠道是口服药物在体内代谢的重要场所,肠道内寄生的大量细菌对药物的生物转化起到了非常重要的作用。目的:通过测定雄黄中的总砷,并对雄黄中的可溶性砷的提取条件进行优化,检测雄黄中可溶性砷的砷形态,初步研究As单元素和雄黄中可溶性砷在肠道菌群作用下的砷形态及砷代谢,测定肠道菌群中的还原型谷胱甘肽(GSH),为阐述肠道菌群中砷形态的生物转化奠定一定的基础。方法:1.采用微波消解-氢化物原子吸收光谱仪和微波消解-电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)分别对雄黄中的总砷进行测定。2.利用Plackett-Burman和Box-Behnken设计优化雄黄中可溶性砷的提取工艺。3.建立高效液相色谱(HPLC)—电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)联用技术同时分离检测AsB、AsC、As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA、DMA六种砷形态化合物的方法,并检测As单元素和雄黄在肠道菌群作用下的砷形态。4.建立DTNB法测定肠道菌群中还原型谷胱甘肽(GSH)。结果:1.微波消解-氢化物原子吸收光谱仪和微波消解-电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测定雄黄中的砷含量以二硫化二砷(As2S2)计分别为96.20%和97.07%。2.利用Plackett-Burman和Box-Behnken设计优化雄黄中可溶性砷的最佳提取工艺为:以水作为提取溶剂,雄黄15mg,水10mL,提取温度80℃,超声提取3次,每次60min,雄黄中可溶性砷占总砷的4.16%。3.建立高效液相色谱(HPLC)—电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)联用技术同时分离检测AsB、AsC、As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA、DMA六种砷形态的方法,采用DionexIonPacTMAS7RFICTM阴离子交换色谱柱(4x250 mm)作为分析柱,流动相A相:3.75 mM碳酸铵,流动相B相:100 mM碳酸铵。梯度洗脱,0.00～3.40 min,100%A;3.50 min 20%A,80%B;4.50～6.00 min 100%B;6.10～8.00 min 100%A。流速为1.2mL/min,进样体积为20μL。实验结果表明,六种砷形态的线性范围为 1～100 ng/mL,R2 均大于 0.9990,检出限为 0.1～0.2ng/mL,精密度 RSD 在 0.93%-1.83%,均小于2%。方法加标回收率为97.28%～105.24%,RSD均小于6%。采用优化后的最佳提取工艺提取雄黄中的可溶性砷。结果表明:雄黄可溶性砷中的砷形态为As(Ⅲ)、As(V),且As(Ⅲ)含量高于As(V)。As单元素中只含有As(V)。采用超声水浴的方法对肠道菌群样品进行提取。实验结果表明:雄黄可溶性砷与As单元素在肠道菌群的作用下,通过HPLC-ICP-MS只检测到的砷形态为As(Ⅲ)、As(V)。4.通过DTNB法测定0-48h肠道菌群中还原型谷胱甘肽(GSH),在0～2 h未检测到GSH,在4 h时达到峰值50.36μg/mL,12～48h 趋于稳定,48h 为 13.30μg/mL。结论:1.雄黄中的砷含量以二硫化二砷(As2S2)计均大于2015版《中国药典》规定的90%,符合药典要求。2.Plackett-Burman和Box-Behnken设计优化雄黄中可溶性砷的提取工艺稳定可靠,实验精度高,与模型预测值基本一致。3.建立HPLC-ICP-MS同时测定六种砷形态,该方法采用As-7阴离子色谱柱分离六种砷形态化合物,分离效果良好,各砷形态化合物都达到了完全分离,能使检测结果更加准确可靠,可运用于雄黄中可溶性砷的砷形态、肠道菌群中的砷形态分析。4.首次通过DTNB法测定肠道菌群中的GSH,表明肠道菌群中存在还原型谷胱甘肽(GSH),可能对无机砷的甲基化代谢过程有着重要的作用,对于无机砷在肠道菌群内的甲基化代谢过程还需进行更为深入的研究。