研究背景急性心肌梗死的发病率逐年增高,严重危及健康,其防治是摆在医务人员面前最艰巨、最困难的任务之一,已成为人类面临的重要公共卫生问题。目前治疗急性心肌梗死的主要干预措施是通过经皮冠脉介入治疗、药物溶栓或冠脉血管旁路移植术迅速开通梗塞相关动脉再灌注。但在临床实践中我们发现在急性缺血心肌再灌注时,这些积极的治疗都伴随着心肌缺血再灌注损伤(myoeardial ischemia-reperfusion injury, MIRI)的影响其治疗效果,同时有可能产生严重不良后果,因此临床亟需有效减轻MIRI的治疗策略。通过应用药物预处理或再灌注后药物干预,有效地减轻MIRI,是目前国内外心血管界研究的热点。国内外专家学者投入大量精力来研究减轻或避免MIRI的方法,却收效甚微,那么具有“扶正”理论基础的我国传统医学在抑制MIRI时能否可以发挥更积极的作用。丹酚酸B(Salvianolic acid B, Sal-B)系丹参的水溶性有效成分,属酚酸类化合物,是丹参水溶性物质中药理活性最强的成分。近年实验研究丹酚酸B能够减轻氧自由基对心肌细胞的毒害作用,减轻炎症反应,保护内皮功能等作用,有可能参与减轻或抑制MIRI。但是目前对于丹酚酸B心肌保护作用的具体机制仍然有很多盲点,仍需不断地探索。MIRI是多因素共同作用的结果。随着对MIRI深入研究发现,PI3K-Akt信号通路在MIRI过程中发挥非常重要的作用,PI3K-Akt信号通路主动募集的细胞内保护机制比其他被动途径可能起着更重要的作用。本课题从多角度、不同水平观察丹酚酸B对心肌缺血再灌注的影响,在分子水平观察丹酚酸B对心肌酶学、氧自由基等影响；在细胞水平观察对心脏心肌细胞凋亡影响；以及从器官水平观察对心脏整体的影响,同时在功能基因组和基因组水平研究Sal-B对凋亡基因蛋白表达的影响。本课题将从以下方面进行探讨：Sal-B对缺血再灌注心脏线粒体功能及心肌细胞凋亡的影响以及对心肌细胞凋亡的抑制作用是否通过PI3K-Akt信号通路实现；在PI3K-Akt信号通路中Sal-B可能的作用靶点；从细胞因子信号通路角度阐述该药可能的作用机制,为中医药治疗心肌缺血再灌注损伤提供理论依据及新的思路。第一部分丹酚酸B对大鼠心肌缺血.再灌注损伤的影响及机制研究目的：通过构建大鼠心肌缺血再灌注损伤的动物模型,观察丹酚酸B对缺血再灌注心肌的心肌酶学、心肌梗死面积的影响,同时探讨丹酚酸B对缺血再灌注心肌保护作用是否是通过P13K-Akt信号通路实现的。方法：1、实验动物采用结扎冠状动脉左旋支,心电图出现ST段明显抬高或压低；再灌注时局部组织充血,出现ST段回落,判断为实验造模成功。2、实验动物分组与处理实验动物被随机分为5组,每组10只。1)假手术组(sham operation group, Sham组)：实验动物只绕冠状动脉左旋支的根部下约2mm的地方穿线,但不结扎。2)心肌缺血再灌注组(MI/R组)：实验动物绕冠状动脉左旋支的根部下约2mm的地方穿线,结扎30min后,再灌注601min。3)丹酚酸B低剂量组(Sal-B20mg/kg组)：结扎30min,再灌注60min,经颈静脉同时给予Sal-B20mg/kg。4)丹酚酸B高剂量组(Sal-B60mg/kg组)：结扎30min,再灌注60min,经颈静脉同时给予Sal-B60mg/kg。5)丹酚酸B高剂量组+PI3K/Akt抑制剂组LY294002(Sal-B60mg/kg+LY组)：结扎30mmin,再灌注60min,经颈静脉同时给予Sal-B60mg/kg以及PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002(0.3mg/kg)。实验结束后留取血液标本,同时取实验动物心肌组织检测。3、全自动生化仪检测血浆cTnI、CK-MB浓度。4、心肌染色测定各组心肌梗死面积。5、通过HE染色观察心肌组织病理形态学变化。结果：1、各实验组血浆CTnI、CK-MB浓度的变化实验结果表明,MI/R组、Sal-B20mg/kg组、Sal-B60mg/kg组、Sal-B60mg/kg+LY组与Sham组相比,血浆中cTnI、CK-MB含量显著升高(P<0.01)。Sal-B20mg/kg组、Sal-B60mg/kg组与MI/R组相比,血浆中cTnI、CK-MB浓度均降低(P<0.01)。Sal-B60mg/kg组与Sal-B20mg/kg组相比,血浆中cTnI、CK-MB浓度降低,Sal-B60mg/kg+LY组与Sal-B60mg/kg组比较,cTnI、CK-MB浓度升高(P<0.01)。2、各实验组大鼠心肌梗死面积的比较：MI/R组(43.3±8.6)%与Sham组(15.2±5.3)%对比,心肌梗死面积显著增加(P<0.01)。Sal-B20mg/kg组(33.5±7.1)%、Sal-B60mg/kg组(20.1±6.5)%与MI/R组对比,心肌梗死面积均显著减少(P<0.01)。Sal-B60mg/kg组与Sal-B20mg/kg组比较,心肌梗死面积减少；Sal-B60mg/kg+LY组(41.3±7.8)%与Sal-B60mg/kg组比较,心肌梗死面积增加P<0.01)。3、各实验组大鼠心肌组织病理形态学变化光镜下Sham组心肌纤维排列整齐,心肌间质无炎细胞浸润。MI/R组、Sal-B60mg/g+LY组心肌纤维肿胀、紊乱,心肌间质出现大量炎细胞浸润,可见明显坏死区,MI/R组最严重；Sal-B20mg/kg组、Sal-B60mg/kg组心肌细胞胞核大小均匀,心肌纤维轻度肿胀,见少量成纤维细胞及炎细胞浸润,与MI/R组、Sal-B60mg/g+LY组比较,心肌炎症侵润明显减轻,心肌肌纤维破坏减轻,心肌局灶性坏死明显减少。Sal-B60mg/kg组比Sal-B20mg/kg组心肌组织变化改善更明显。结论：1、Sal-B在心肌缺血再灌注时,具有心肌保护作用,可以降低CK-MB、cTNI水平,减少心肌梗死的面积,发挥对心脏的保护功能。2、Sal-B对缺血再灌注心肌的保护作用与丹酚酸B用量相关,呈剂量依赖性,高剂量时作用更显著。3、Sal-B通过PI3K-Akt信号通路发挥对缺血再灌注心肌的保护作用。第二部分丹酚酸B通过PI3KAkt信号通路干预缺血再灌注大鼠心肌细胞凋亡的研究目的：观察丹酚酸B对缺血再灌注心肌的心肌细胞凋亡的影响,探讨PI3K-Akt信号通路在心肌细胞凋亡时的作用及作用靶点。方法：1、应用Tunel法检测各实验组心肌细胞凋亡指数。2、应用免疫组织化学检测Bax、Bcl-2蛋白在心肌组织中的表达3、应用Western blot测定心肌组织caspase-3蛋白水平、总Ak(T-Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)信号蛋白的表达水平。结果：1、各实验组心肌细胞凋亡指数的变化各实验组细胞凋亡指数(%)：Sham组(1.12+0.02)、MI/R组(36.12±4.37)、Sal-B20mg/kg组(22.02±3.56)、Sal-B60mg/kg组(12.57±2.93)、Sal-B60mg/kg+LY组(35.12±1.03)。MI/R组、Sal-B20mg/kg组、Sal-B60mg/kg组、Sal-B60mg/kg+LY组与Sham组相比,凋亡指数均升高(P<0.01)。Sal-B20mg/kg组、Sal-B60mg/kg组与MI/R组相比,心肌细胞凋亡指数均降低(P<0.01)。Sal-B60mg/kg组与Sal-B20mg/kg组、Sal-B60mg/kg+LY组相比心肌细胞凋亡指数均显著降低(P<0.01)。2、各实验组免疫组织化学检测Bcl-2和Bax蛋白表达的变化MI/R组、Sal-B20mg/kg组、Sal-B60mg/kg组、Sal-B60mg/kg+LY组与Sham组相比,Bax蛋白表达水平显著升高,凋亡抑制蛋白Bcl-2表达降低(P<0.01)。Sal-B20mg/kg组、Sal-B60mg/kg组与MI/R组相比,Bax蛋白表达水平降低,Bcl-2表达显著升高(P<0.01)。Sal-B60mg/kg组与Sal-B20mg/kg组比较Bax蛋白表达水平降低,Bcl-2表达显著升高(P<0.01)。Sal-B60mg/kg+LY组与Sal-B60mg/kg组相比较Bcl-2表达降低,Bax蛋白表达水平升高(P<0.01)。3、各实验组caspase-3蛋白表达的变化MI/R组、Sal-B20mg/kg组、Sal-B60mg/kg组、Sal-B60mg/kg+LY组与Sham组相比,caspase-3蛋白表达显著升高(P<0.01)。Sal-B20mg/kg组、Sal-B60mg/kg组与MI/R组相比,caspase-3蛋白表达水平降低(P<0.01)。Sal-B60mg/kg组与Sal-B20mg/kg组比较,caspase-3蛋白表达水平降低(P<0.01)。 Sal-B60mg/kg+LY组与Sal-B60mg/kg组相比较,caspase-3蛋白表达增加(P<0.01)。4、各实验组总Akt蛋白,p-Akt蛋白表达的变化各组总Akt差异无统计学意义；MI/R组、Sal-B20mg/kg组、Sal-B60mg/kg组、Sal-B60mg/kg+LY组与Sham组相比,p-Akt蛋白表达降低(P<0.01)。Sal-B20mg/kg组、Sal-B60mg/kg组与MI/R组相比,p-Akt蛋白表达增加(P<0.01)。Sal-B60mg/kg组与Sal-B20mg/kg组比较,p-Akt蛋白表达升高(P<0.01)。与Sal-B60mg/kg组相比较,Sal-B60mg/kg+LY组降低了p-Akt蛋白表达(P<0.01)。结论：1、丹酚酸B在MIRI时能够抑制心肌细胞凋亡,增加Bal-2蛋白表达,减少Bax蛋白、caspase-3蛋白水平。2、丹酚酸B能够增加p-AKT蛋白表达,提示丹酚酸B通过P13K-Akt信号通路来调控凋亡相关基因的表达,从而抑制心肌细胞凋亡,减轻MIRI。第三部分丹酚酸B通过P13K-Akt信号通路保护缺血再灌注大鼠心肌细胞线粒体功能的研究目的：本实验在分子水平观察Sal-B对心肌缺血再灌注时心肌细胞线粒体ROS含量和血浆T-SOD、MDA含量的影响,观察线粒体在心肌缺血再灌注损伤时的变化。方法：1、激光共聚焦检测心肌细胞线粒体ROS含量变化。2、酶联免疫吸附法测定血浆T-SOD、MDA浓度变化。3、电镜观察心肌超微结构变化。结果：1、各实验组ROS含量的变化与Sham组相比,MI/R组ROS荧光增强,提示MI/R条件下ROS生成增加;与MI/R组相比,Sal-B20mg/kg组、Sal-B60mg/kg组ROS荧光强度减弱,提示在MIRI时Sal-B可减少ROS生成。Sal-B60mg/kg组与Sal-B20mg/kg组Sal-B60mg/kg+LY组比较,ROS生成减少(P<0.01)。2、各实验组血浆T-SOD、MDA含量的变化MI/R组、Sal-B20mg/kg组、Sal-B60mg/kg组、Sal-B60mg/kg+LY组与Sham组相比,血浆MDA含量明显升高,血浆T-SOD含量显著降低,(P<0.01)。Sal-B20mg/kg组、Sal-B60mg/kg组与MI/R组相比,血浆MDA含量明显具有降低趋势,血浆T-SOD含量显著升高(P<0.01)。Sal-B60mg/kg组与Sal-B20mg/kg组、Sal-B60mg/kg+LY组比较,血浆MDA含量明显具有降低趋势,血浆T-SOD含量显著升高(P<0.01)。3、各实验组心肌细胞超微结构改变Sham组：心肌细胞形态良好,肌膜完整；细胞核清晰；线粒体结构完整；心肌纤维排列有序,肌节周期性的结构正常,明暗显示清晰,闰盘无扩张,Z线无变形,肌丝完整。MI/R组：心肌细胞肿胀明显,肌膜断裂、缺损,肌膜下胞质水肿；细胞核皱缩,核膜模糊;线粒体损伤明显,呈空泡状,甚至溶解；心肌纤维排列紊乱,细胞间质中有大量胶原纤维,肌浆网扩张；肌节周期性的结构被破坏,明暗带不清晰,Z线变形、扭曲,肌丝断裂；闰盘局部扩张。Sal-B20mg/kg组：细胞轻微肿胀,心肌纤维整齐排列且密集,胶原纤维含量明显较多,线粒体有肿胀,并出现融合现象,部分排列较乱、断裂,与MI/R组相比较,情况改善。Sal-B60mg/kg组：大部分细胞核很完整、清晰可见,只有少部分细胞核膜不完整,线粒体结构基本正常且排列整齐、规则,有部分断裂及碎片形成,心肌纤维整齐排列,细胞间质中胶原纤维含量较少。加入PI3K-Akt信号通路的特异性阻断剂后,Sal-B60mg/kg+IY组与Sal-B60mg/kg组比较,超微结构的改变加重。结论：1、丹酚酸B能够降低氧自由基、抑制氧化应激反应,发挥保护心脏作用,减轻心肌缺血再灌注损伤。2、丹酚酸B抑制氧化应激及保护线粒体功能的作用是通过PI3K-Akt信号通路实现的。第四部分丹酚酸B对心肌缺血再灌注大鼠血浆sICAM-1、 sVCAM-1水平及NF-KB p65表达的影响和机制研究目的：观察丹酚酸B对心肌缺血再灌注损伤大鼠血浆sICAM-1、sVCAM-1水平及NF-κB p65表达的影响,探讨PI3K-Akt信号通路的作用。方法：1、ELISA法检测血浆sICAM-1浓度2、ELISA法检测血浆sVCAM-1浓度检测3、western blot检测心肌组织NF-κB p65含量结果：1、各实验组血浆sICAM-1浓度的变化实验结果显示：MI/R组、Sal-B20mg/kg组Sal-B60mg/kg组、Sal-B60mg/kg+LY组与Sham组相比,血浆中sICAM-1浓度升高(P<0.01),MI/R组血浆中sICAM-1浓度最高。Sal-B20mg/kg组、Sal-B60mg/kg组与MI/R组相比,血浆中sICAM-1浓度均有降低(P<0.01)。Sal-B60mg/kg组与Sal-B20mg/kg组比较,sICAM-1浓度降低(P<0.01)。Sal-B60mg/kg+LY组与Sal-B60mg/kg组比较,sICAM-1浓度上升(P<0.01)。2、各实验组血浆sVCAM-1浓度的变化MI/R组、Sal-B20mg/kg组、Sal-B60mg/kg组、Sal-B60mg/kg+LY组与Sham组相比,血浆中sVCAM-1浓度显著升高(P<0.01),MI/R组血浆中sVCAM-1浓度最高。Sal-B20mg/kg组、Sal-B60mg/kg组与MI/R组相比,血浆中sVCAM-1浓度均降低(P<0.01)。Sal-B60mg/kg组与Sal-B20mg/kg组比较,sVCAM-1浓度降低(P<0.01)。Sal-B60mg/kg+LY组与Sal-B60mg/kg组比较,sVCAM-1浓度升高。3、各实验组心肌组织NF-κB p65含量的变化MI/R组、Sal-B20mg/kg组、Sal-B60mg/kg组、Sal-B60mg/kg+LY组与Sham组相比,NF-κB p65表达显著升高(P<0.01)。Sal-B20mg/kg组、Sal-B60mg/kg组与MI/R组相比,NF-KBp65表达均降低(P<0.01)。Sal-B60mg/kg组与Sal-B20mg/kg组、Sal-B60mg/kg组与Sal-B60mg/kg+LY组比较,NF-κB p65表达均降低(P<0.01)。结论：1、丹酚酸B通过减少sICAM-1、sICAM-1生成,改善心肌微循环障碍,发挥缺血再灌注时心肌保护作用。2、丹酚酸B抑制炎症反应,改善心肌微循环的作用是通过PI3K-Akt信号通路调控,经NF-κB信号途径实现的。第五部分丹酚酸B对心肌缺血再灌注大鼠钙敏感受体的影响及机制研究目的：观察丹酚酸B对心肌缺血再灌注损伤大鼠钙敏感受体的影响,探讨PI3K-Akt信号通路对心肌缺血再灌注时钙敏感受体的影响。方法：1、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测心肌组织中CaSRmRNA转录。2、免疫组织化学检测CaSR蛋白表达。结果1、各实验组心肌组织中CaSRmRNA表达变化本实验结果显示：MI/R组、Sal-B20mg/kg组、Sal-B60mg/kg组、Sal-B60mg/kg+LY组与Sham组相比,CaSRmRNA表达水平升高(P<0.01),MI/R组CaSRmRNA表达最高,说明在心肌缺血再灌注损伤时CaSR表达增加。SaI-B20mg/kg组、Sal-B60mg/kg组与MI/R组相比,CaSRmRNA表达水平降低(P<0.05)。Sal-B60mg/kg+LY组与Sal-B60mg/kg组相比,CaSRmRNA表达水平升高(P<0.05)。2、各实验组免疫组织化学检测CaSR蛋白表达的变化实验结果：MI/R组、Sal-B20mg/kg组、Sal-B60mg/kg组、Sal-B60mg/kg+LY组与Sham组相比,CaSR蛋白表达升高(P<0.01),在MI/R组最高。Sal-B60mg/kg组与MI/R组相比较,CaSR蛋白表达水平降低(P<0.05)。Sal-B60mg/kg+LY组与Sal-B60mg/kg组相比,CaSR蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论：1、在MIRI时,心肌钙敏感受体表达增多,提示钙敏感受体参与了MIRI；2、应用丹酚酸B能够减少MI/R时CaSR在心肌细胞的表达,提示丹酚酸B有可能通过调节CaSR的表达在缺血再灌注心肌损伤发挥作用。3、本实验探讨中药对钙敏感受体的影响,国内研究甚少,本实验在不同视角下深入研究传统中药的作用机制。