蛋白质的亚细胞定位对于深入了解与研究其在细胞中的生理功能至关重要。将目标蛋白质与细胞内各细胞器和囊泡运输的报告蛋白进行共同表达时空分析,是一种方便且有效用于揭示目标蛋白的亚细胞定位和阐明其生物学功能的研究手段。传统的蛋白质共表达方法一般需要采用多个独立的蛋白表达载体来分别表达荧光融合蛋白,因此具有系列局限,其中包括:蛋白质共表达效率低、各载体表达水平有差异以及共表达转基因植株的获得需要转化、杂交和后续遗传筛选需时较长等缺点。在本研究中,我们建立了一个能够在植物中共表达多种荧光融合蛋白的新型高效的实验体系,并利用该体系来研究植物细胞内蛋白质极性转运的分子作用机理。首先,我们构建由多个半独立蛋白表达盒组成的表达载体,并在细胞中对该载体进行瞬时或稳定遗传表达,从而实现利用单一载体高效共表达多种荧光融合蛋白。为了验证该方法的可行性,我们分别在几种植物细胞中共同表达荧光融合的液泡分选受体和分泌载体膜蛋白。结果表明,它们的亚细胞定位与前人研究结果一致,说明该新实验体系完全有效可行。同时,与传统的植物蛋白共表达方法相比,这一新型的植物蛋白表达方法具有诸多优点。其每个蛋白质表达盒都含有各自独立的表达元件如启动子或终止子,可根据不同的蛋白质表达需求来进行灵活组合。此外,该方法中DNA片段的连接、蛋白质表达盒的组装和最终表达载体构建可以方便快捷地通过优化的一步法反应实现,无需额外酶切和连接反应。同时,它完全兼容目前基于荧光蛋白的生物成像技术和分析方法,如FRET和BiFC。同时,该新系统可以显著提高制备多蛋白共表达遗传转化植物的效率,缩短纯合体筛选所需时间。其次,利用该新型蛋白质共表达系统对植物细胞壁合成酶极性运输进的分子调控机制开展研究。植物细胞壁是植物细胞的重要结构,主要由纤维素和果胶,以及其他多糖和蛋白质等组成。这些细胞壁组分的形成需要多种细胞壁合成酶的参与,包括纤维素合酶,果胶甲基酯酶和胼胝质合酶。其中果胶甲酯酶NtPPME1在高尔基体中以囊泡形式分泌到细胞膜,纤维素合酶复合物和胼胝质合酶复合物通过反式高尔基网状体分泌的囊泡运输到细胞膜。然而,纤维素合酶,果胶甲基酯酶和胼胝质合酶极性分泌过程的分子作用机制尚未被研究清楚。我们利用新建立的蛋白共表达体系,以快速增长的花粉管细胞为实验材料,通过激光共聚焦电子显微镜技术探索纤维素合酶,果胶甲基酯酶和胼胝质合酶极性分泌与胞吐复合体之间的关系。