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目的:弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL）按照细胞起源分为生发中心B细胞样（germinal center B-cell-like,GCB）亚型和活化B细胞（activated B-cell-like,ABC）亚型,其中ABC型预后较差。故在R-CHOP（利妥昔单抗（rituximab,RTX）、环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松）方案的基础上联合小分子靶向药物从而增强ABC型DLBCL患者对利妥昔单抗的敏感性成为了目前的研究热点。有研究表明,BTK抑制剂可以抑制BTK磷酸化而在ABC型DLBCL患者中疗效显著,而与第一代BTK抑制剂伊布替尼相比,新型BTK抑制剂对DLBCL作用的机制有些许变化,但目前尚未完全阐明。故本研究探索了新型BTK抑制剂阿卡替尼（acalabrutinib,ACP-196）及泽布替尼（zanubrutinib,BGB-3111）联用利妥昔单抗（RTX）对ABC型DLBCL细胞株的杀伤作用,以及对各T细胞亚群功能,尤其是对Th17细胞的影响,并初步探讨了新型BTK抑制剂调节白细胞介素17（interleukin-17,IL-17）分泌的机制。研究内容与方法:1.用不同浓度的阿卡替尼或泽布替尼分别处理ABC型DLBCL细胞株（NU-DUL-1和SU-DHL-2）48 h后,采用CCK-8法检测细胞活力抑制率,并计算半数抑制浓度(half inhibitory concentration,IC50)。2.以20%新鲜正常人血清为补体来源,7-氨基放线菌素D（7-amino-actinomycin D,7-AAD）流式染色检测新型BTK抑制剂阿卡替尼及泽布替尼联合RTX补体依赖的细胞毒性（complement dependent cytotoxicity,CDC）效应对ABC型DLBCL细胞株NU-DUL-1、SU-DHL-2以及RTX耐药株NU-DUL-1-R的杀伤效果。3.羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（carboxyfluorescein succini-midyl ester,CFSE）标记肿瘤细胞后建立外周血单个核细胞与肿瘤细胞（效靶比为5:1）共培养体系,流式染色检测新型BTK抑制剂阿卡替尼及泽布替尼联合RTX抗体依赖的细胞毒性（antibody dependent cell mediated cytotoxicity,ADCC）效应诱导的细胞死亡率。4.流式染色检测新型BTK抑制剂联合或不联合RTX对共培养体系中各T细胞亚群功能,尤其是对Th17细胞的影响,并用ELISA检测IL-17的分泌水平。5.流式检测新型BTK抑制剂对ABC型DLBCL细胞表面CD20表达的影响。6.用新型BTK抑制剂阿卡替尼及泽布替尼处理纯化的CD4+T细胞48 h,Western blot检测细胞中NF-κB-p65磷酸化的表达,q PCR检测细胞中RORc及IL-17 m RNA的表达情况,ELISA检测IL-17分泌的情况。7.建立小鼠B细胞淋巴瘤模型来验证BTK抑制剂泽布替尼对淋巴瘤的体内抑制作用,以及对Th17细胞比例和IL-17分泌的影响。结果:1.阿卡替尼对NU-DUL-1和SU-DHL-2细胞的IC50分别为12.51μmol/L和30.58μmol/L,泽布替尼对NU-DUL-1和SU-DHL-2细胞的IC50分别为5.90μmol/L和22.64μmol/L。2.对于RTX的CDC效应,相较于单药组,阿卡替尼与RTX联用后对NU-DUL-1、SU-DHL-2细胞及RTX耐药株NU-DUL-1-R细胞的杀伤作用均增强。泽布替尼的联用效果与阿卡替尼类似。3.对于RTX的ADCC效应,相较于单药组,阿卡替尼与RTX联用后对肿瘤细胞的杀伤作用均增强,诱导的细胞死亡率均升高。泽布替尼与RTX联用后对肿瘤细胞的杀伤作用也均增强。4.新型BTK抑制剂阿卡替尼及泽布替尼均能下调Th17细胞的比例,并促进CD8+T细胞中颗粒酶B及TNF-α的分泌。新型BTK抑制剂与RTX联用后逆转了RTX导致的Th17比例的升高和IL-17分泌水平的上调。5.新型BTK抑制剂对于NU-DUL-1、NU-DUL-1-R及SU-DHL-2细胞表面CD20蛋白表达基本无影响。6.新型BTK抑制剂阿卡替尼及泽布替尼均可以抑制CD4+T细胞中NF-κB-p65磷酸化,q PCR结果也表明新型BTK抑制剂能下调CD4+T细胞中的RORc及IL-17 m RNA的相对表达量,ELISA结果表明CD4+T细胞分泌的IL-17水平降低。7.泽布替尼可以有效控制动物模型体内肿瘤生长,并且也抑制了小鼠外周血和脾脏淋巴细胞中Th17细胞的分化,并下调了外周血中IL-17的水平。结论:1.新型BTK抑制剂可以增强RTX的CDC效应及ADCC效应对ABC型DLBCL细胞的杀伤作用,并增强了RTX耐药株对RTX的敏感性。2.新型BTK抑制剂增强了CD8+T细胞的抗肿瘤作用,下调了CD4+T细胞中Th17细胞的比例,减少了IL-17的分泌,从而恢复了RTX作用之后Th17比例的失衡。3.新型BTK抑制剂可以通过抑制CD4+T细胞中NF-κB-p65磷酸化水平来下调IL-17的分泌水平,也在体内抑制了Th17细胞的分化以及下调了IL-17的水平。