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研究背景肺癌是世界上发病率与死亡率最高的恶性肿瘤,每年导致全球约160万人的死亡。早期肺癌的症状具有隐匿性,导致患者在初诊时往往已经丧失手术机会,使得化疗或化疗联合放射治疗成为肺癌晚期患者的主要治疗手段。尽管近年来肺癌的治疗不断创新发展,肺癌患者的5年生存率仍然低至15%。对肺癌发病及进展的病理生理机制的认识不足,可能是肺癌治疗发展进入瓶颈期的原因之一。近年来,肿瘤干细胞理论从提出到证实,为肿瘤的概念和治疗角度都引入了新的思路。研究发现,肿瘤组织并非由单一类型的肿瘤细胞组成,相反其组成细胞具有很强的异质性。肿瘤干细胞亚群在肿瘤组织中仅占有很小的比例,然而却具有很强的成球、自我更新、迁移侵袭和启动肿瘤生长的能力。肿瘤干细胞亚群的起源尚不清楚,有研究认为其起源于肿瘤细胞上皮间质转化过程中的重编程。尽管肿瘤干细胞在肿瘤的进展及治疗中起着关键性作用,而其在分子水平上对其固有的干细胞特性的调控机制尚不清楚。转化生长因子β1作为TGF-β超家族的一员,是一种多效性的与上皮性肿瘤生长有关的细胞负调控因子,可诱导肿瘤细胞发生上皮间质转化,从而赋予了转化后的细胞干细胞样特性。大量研究结果表明TGFβ1主要通过蛋白质-蛋白质相互作用发挥其调控作用,而关于miRNA参与此过程的证据尚无文献报道。miRNA是长度仅为18-22个碱基的非编码RNA,参与多种细胞生物过程的调控。miRNA与包括恶性肿瘤在内的多种人类疾病相关。不同于mRNA,miRNA有着相对稳定、长度较短以及可显著调控靶基因表达等特性,这使得miRNA成为一种新的生物标记物和潜在的治疗靶点。目前,对miRNA在TGFβ1调控的肺癌细胞EMT发生及CSC干性维持中所发挥的作用尚不明确。因此,为了寻找可能参与TGFβ1诱导的EMT发生和CSC维持的miRNA,本研究拟利用高通量测序技术筛选参与调控TGFβ1诱导肺癌干细胞亚群富集过程的关键miRNA,进一步结合文献调研选择表达谱中存在明显差异的miR-138-5p,对其具体机制作以深入研究。第一部分筛选参与调控TGFβ1介导的肺癌干细胞亚群富集过程的关键miRNA研究目的筛选参与调控TGFβ1介导的肺癌干细胞亚群富集过程的关键miRNA。研究方法1.从细胞形态上观察TGFβ1对原代肺癌细胞LC006和LC021的上皮间质转化的诱导作用。2.用实时荧光定量PCR法检测TGFβ1诱导后原代肺癌细胞LC006和LC021的上皮间质转化相关基因表达水平变化。3.用流式细胞术分析TGFβ1诱导后原代肺癌细胞LC006和LC021的肿瘤干细胞比例变化。4.借助流式细胞仪分选TGFβ1诱导后的原代肺癌细胞LC021中的肿瘤干细胞和非干细胞亚群,利用高通量测序技术分析经TGFβ1诱导富集的肺癌干细胞亚群中差异表达的miRNA。研究结果1.TGFβ1可诱导原代肺癌细胞发生上皮间质转化,且其向间质形态转化的程度具有时间依赖性。2.TGFβ1可诱导原代肺癌细胞中肿瘤干细胞亚群的富集,且其干细胞亚群富集比例具有时间依赖性。3.TGFβ1诱导富集的肺癌干细胞亚群中存在65个显著差异的已知miRNA和8个显著差异的未知miRNA。研究结论TGFβ1诱导富集的肺癌干细胞亚群中存在65个显著差异的已知miRNA和8个显著差异的未知miRNA。第二部分TGFβ1通过下调miR-138-5p促进肺癌细胞上皮间质转化及干细胞特性的机制研究研究目的探究TGFβ1通过抑制miR-138-5p的表达对肺癌细胞上皮间质转化及其干细胞特性的调控作用及机制。研究方法1.用实时荧光定量PCR法检测TGFβ1诱导后原代肺癌细胞LC006和LC021及肺癌细胞系A549的miR-138-5p的表达水平变化。2.通过构建miR-138-5p过表达及敲减的重组慢病毒载体,建立miR-138-5p稳定过表达及低表达的肺癌细胞系。3.通过实时荧光定量PCR法,检测不同miR-138-5p表达水平的肺癌细胞的上皮间质转化相关基因表达水平变化。4.通过细胞划痕实验,对比不同miR-138-5p表达水平肺癌细胞迁移能力。5.通过单克隆形成实验,观察不同miR-138-5p表达水平的肺癌细胞的单细胞克隆形成能力差异。6.利用平板集落形成试验,分析不同miR-138-5p表达水平的肺癌细胞的平板集落形成能力差异。7.利用MTS法,检测不同miR-138-5p表达水平的肺癌细胞对化疗药物顺铂和紫杉醇的敏感性差异。研究结果1.TGFβ1可下调肺癌细胞的miR-138-5p表达水平,且其下调程度具有时间依赖性。2.miR-138-5p可逆转肺癌细胞上皮间质转化的发生。3.miR-138-5p可减弱肺癌细胞的迁移能力。4.miR-138-5p可降低肺癌细胞的单细胞克隆形成能力。5.miR-138-5p可抑制肺癌细胞的平板集落形成能力。6.miR-138-5p可增加肺癌细胞对化疗药物的敏感性。研究结论TGFβ1通过下调miR-138-5p促进肺癌细胞上皮间质转化及其干细胞特性,从而降低肺癌细胞对化疗药物的敏感性。结论1.TGFβ1诱导富集的肺癌干细胞亚群中存在65个显著差异的已知miRNA和8个显著差异的未知miRNA。2.TGFβ1通过下调miR-138-5p促进肺癌细胞上皮间质转化及其干细胞特性,从而降低肺癌细胞对化疗药物的敏感性。