目的：　　角膜无血管化状态维持着角膜的免疫赦免和透明性，眼外伤、感染、角膜移植等可引起角膜新生血管，影响视力甚至致盲，角膜新生血管也是引起角膜移植免疫排斥发生的重要原因。针对角膜新生血管发生过程中的炎症和血管内皮细胞变化，发展了诸多抑制角膜新生血管的药物及方法，如糖皮质激素、FK506、抗VEGF等。常规缝线诱导角膜新生血管模型中存在角膜张应力的变化，张应力变化会诱导角膜中VEGF水平的升高，从而诱导角膜新生血管，但对于张应力如何调控角膜VEGF表达，进而影响角膜新生血管的机制还不明确。　　本研究拟检测已知的microRNAs在缝线和碱烧伤诱导的两种小鼠角膜新生血管模型中的表达变化，筛选出变化最为明显的microRNA；通过缝线诱导的小鼠角膜新生血管模型，检测该microRNA的表达定位，及其对新生血管形成的影响和机制；进一步通过体外培养人角膜上皮细胞和微血管内皮细胞，观察张应力变化对该microRNA表达及其对微血管内皮细胞的影响。　　方法：　　1. 碱烧伤和缝线诱导的角膜新生血管中microRNAs的表达变化　　选择成年6~8周龄BALB/c小鼠为实验动物，碱烧伤模型采用浸润1N氢氧化钠的滤纸（直径2mm）置于角膜中央，作用40秒后，立即以生理盐水冲洗40秒，眼表涂氧氟沙星眼膏；缝线模型采用11-0线在角膜旁中央区板层放射状缝合2针；术后10天取角膜，RT-PCR检测角膜中miR-10a、16、24、101a、126b、184、200b、204的表达情况。　　2. 角膜新生血管中miR-204的表达变化和定位　　建立小鼠角膜缝线模型，术后通过裂隙灯观察新生血管生长情况，术后10天拆除缝线，观察至20天取角膜；RT-PCR分别检测角膜上皮和基质中miR-204的表达情况。取人正常角膜和人新生血管化的病变角膜，RT-PCR检测角膜上皮中miR-204的表达情况。　　取人正常角膜、人新生血管化的病变角膜、正常小鼠角膜和新生血管化小鼠角膜，用原位杂交法检测miR-204在角膜中的表达位置。　　3. MiR-204对角膜新生血管的影响　　建立角膜缝线模型，将角膜缝线小鼠随机分为：　　（1）PBS组：结膜下注射PBS；　　（2）NTC组：结膜下注射NTC（agomir negative control）；　　（3）miR-204 agomir组：分别在缝线0天、3天、6天结膜下注射。　　术后3天、5天、7天、10天裂隙灯显微镜观察，术后10天取角膜；CD31标记角膜新生血管，角膜铺片统计并比较角膜新生血管面积；免疫组织化学和Western blot检测VEGF-A、VEGF-C、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3的表达变化。　　4. MiR-204对人角膜上皮细胞VEGF-A表达的影响　　体外培养人原代角膜上皮细胞，分为：　　（1）正常对照组；　　（2）加力+NTC组；　　（3）加力+miR-204 agomir组；　　以Flexcell加力装置对细胞进行张应力作用（拉伸度5%，频率为1Hz，6小时），收取细胞，RT-PCR检测miR-204及VEGF-A的表达变化， Western blot检测VEGF-A蛋白水平的变化。　　5. MiR-204对人微血管内皮细胞增殖、迁移及成管能力的影响　　体外培养人微血管内皮细胞，分为：　　（1）正常对照组；　　（2）NTC组；　　（3）miR-204 agomir组；　　培养基中加NTC或miR-204 agomir处理后，CCK8法检测细胞增殖力、划痕法比较细胞迁移面积以及统计成管能力。　　结果：　　1. 角膜新生血管中microRNAs的表达变化　　在缝线诱导的角膜新生血管模型中，术后第3天角膜缘即出现新生血管芽，到第10天时角膜水肿，血管生长旺盛，到达缝线位置甚至超越缝线；10天RT-PCR检测发现：miR-16、24、126b、184、200b、204低表达，miR-10a、101a表达无明显变化。　　在碱烧伤诱导的角膜新生血管模型中，术后2~3天角膜缘出现新生血管，10天取角膜RT-PCR检测，与正常角膜比较，新生血管化角膜中：miR-10a、16、24、184、204低表达，miR-126b、200b高表达，miR-101a表达无明显变化。　　2. MiR-204在新生血管化角膜中的表达变化　　角膜缝线10天时，角膜新生血管生长旺盛，RT-PCR检测到miR-204的表达水平明显低于正常角膜（p<0.05）；而且，与角膜松缝线比较，角膜紧缝线诱发更多的新生血管生长、miR-204降低更明显。10天拆除角膜缝线，观察至20天血管明显消退，取角膜，RT-PCR检测miR-204表达明显高于10天时miR-204的表达（p<0.05）；从而确定miR-204在抑制角膜新生血管方面发挥重要作用。　　3. MiR-204主要表达在角膜上皮细胞　　分别对人、小鼠的正常、带血管的角膜上皮和基质进行RT-PCR检测，结果显示， miR-204表达变化主要发生于角膜上皮细胞；采用原位杂交法进一步验证miR-204在角膜中的表达，发现其在正常角膜上皮中高表达，而发生角膜新生血管后，miR-204在上皮中的表达明显降低。因此证实，在正常角膜中，miR-204主要位于角膜的上皮细胞；在发生角膜新生血管时，miR-204的表达变化主要位于角膜上皮。　　4. MiR-204抑制小鼠角膜新生血管　　与PBS组和NTC组相比，结膜下注射miR-204 agomir后，角膜新生血管面积明显减少，VEGF-A和VEGFR2表达水平明显下降。说明miR-204通过降低VEGF-A和VEGFR2来发挥其抑制角膜新生血管的作用。同时，结膜下注射miR-204 agomir具有抑制角膜新生淋巴管的作用。　　5. MiR-204对人角膜上皮细胞VEGF-A表达的影响　　体外培养人原代角膜上皮细胞，在周期性张应力作用下，人角膜上皮细胞的miR-204表达明显降低，同时伴有VEGF-A表达升高；经过miR-204 agomir处理的细胞再用同样的张应力作用时，VEGF-A水平明显降低。说明miR-204有降低周期性张应力引起的细胞高表达VEGF-A的作用。　　6. MiR-204抑制人微血管内皮细胞增殖、迁移及成管　　MiR-204 agomir对人微血管内皮细胞的增殖能力有明显的抑制作用（p<0.05）；与NTC处理的细胞相比较，miR-204 agomir处理的细胞的迁移面积降低了约30%（p<0.05）；此外，成管实验中，经miR-204 agomir转染的人微血管内皮细胞成管数量（0.58±0.08）也明显少于对照（1.02±0.16）（p<0.05）。　　结论：　　1. 在缝线或碱烧伤诱导的角膜新生血管模型及人新生血管化角膜中，miR-204降低明显。　　2. 角膜紧缝线更易诱发角膜新生血管，新生血管化的角膜miR-204表达低；角膜上皮源性的miR-204通过调控VEGF-A和VEGFR2的表达而发挥抑制角膜新生血管的作用；机械力调控miR-204的表达，miR-204通过降低VEGF-A和VEGFR2的表达而发挥抑制角膜新生血管的作用。　　3. 周期性张应力刺激引起角膜上皮细胞miR-204表达水平下降，同时VEGF-A表达水平上升；外源性增强miR-204的表达能抑制周期性张应力引起的角膜上皮细胞高表达VEGF-A，并抑制人微血管内皮细胞的增殖、迁移及血管形成能力。　　创新和意义　　本课题首次证实在缝线诱导的小鼠角膜新生血管模型中，角膜上皮表达的miR-204具有抑制角膜新生血管的作用。体外实验证实缝线引起的周期性张应力可调控角膜上皮细胞miR-204的表达，外源性miR-204 agomir抑制VEGF-A和VEGFR2的表达，以及微血管内皮细胞的增殖、迁移和成管能力。本研究为更好的理解角膜新生血管的发生机制提供新的依据，为临床治疗角膜新生血管提供新的思路。