棉铃虫是常见的农业害虫,危害多种重要经济作物。杀虫剂的长期使用导致棉铃虫产生较强的抗药性和Bt抗虫棉耐受,因此迫切需要继续开发安全高效的生物杀虫剂。胆固醇运输蛋白2(SCP-2)是昆虫体内一种重要的非特异性固醇运输蛋白,为开发新型农药提供了优良的潜在靶点。本研究从两个方面展开,一方面运用NMR结构解析、分子对接、突变体功能测定等技术手段,在蛋白质水平上分析棉铃虫SCP-2蛋白的三维结构和重要的功能位点,为基于HaSCP-2蛋白结构快速筛选棉铃虫抑制剂提供条件。取得如下研究结果：(1)构建pGEX-KG-HaSCP-2融合表达载体,使用终浓度0.2raM IPTG在28℃条件下诱导表达10 h、通过GST亲和层析、Thrombin酶切、阴离子交换层析和分子筛柱分离,建立起HaSCP-2蛋白快速高效的表达纯化程序。(2)基于文献检索、蛋白质序列比对、MALDI-TOF质谱和NMR HSQC谱图分析等,对蛋白进行了截短优化。通过去除HaSCP-2蛋白N端16个氨基酸、C末端4个氨基酸,同时添加TritonX- 100分子,成功获得可用于NMR结构分析用蛋白样品。NBD-胆固醇结合测定表明截短优化后不改变蛋白和胆固醇的亲和能力。(3)基于NMR技术获得了HaSCP-2蛋白在溶液中的三维结构。结果显示HaSCP-2蛋白由5个α-螺旋和4个β-折叠组成,4个β-折叠位于一个平面上和处于该平面同侧的α-螺旋共同构成了包含入口和出口的内部空腔,为脂类分子结合和转运提供疏水性通道。结构比较发现该蛋白和兔源SCP-2蛋白的结构相似度最高,达到47%。HaSCP-2蛋白NMR结构数据已经上传PDB数据库,登录号为4UEI。(4)利用SYBYL-7.3进行蛋白和脂分子配体的柔性对接。对接结果显示Y51、F53、F89、I91、F110、I117、Q131等位点可能是蛋白和固醇分子的结合位点。通过蛋白点突变和NBD-胆固醇结合测定发现Y51A,Y51W、F53A、F53W、F89A、F110W、I117M、Q131A等突变体蛋白和胆固醇结合能力下降,I91M突变体溶解性较差未能成功纯化,表明这些位点可能是胆固醇和HaSCP-2蛋白结合时的相互作用位点。(5)分子对接显示抑制剂AeSCPI-1和mangostin可以和HaSCP-2蛋白结合。竞争性结合测定显示这两种抑制剂均可以抑制HaSCP-2和NBD-胆固醇的结合。另外生物测定也发现3龄幼虫饲喂这两种抑制剂后,虫体脂肪体内胆固醇含量发生显著下降。另一方面,本研究克隆和分析了调控棉铃虫SCP-2表达的SCPX/SCP-2基因启动子序列,为后期研究该基因表达调控机理打下重要基础。主要取得以下研究结果：(1)通过染色体步移,成功克隆了棉铃虫SCPX/SCP-2基因ORF区上游约8kb侧翼序列。(2)构建截短启动子/荧光素酶报告基因重组质粒,采用双荧光素酶报告基因检测系统测定了启动子不同区域的活性,结果表明其中位于3’端1.8kb区域启动子最高,推测该区域对调控HaSCP-X/SCP-2基因表达非常重要。(3)通过5’-RACE分析,发现棉铃虫SCP-X/SCP-2基因启动子区存在多个转录起始位点,转录调控较为复杂。(4)HaSCPX/SCP-2启动子的生物信息学分析发现,该转录起始位点上游37nt区域可能存在CEBP、AP-1、TGIF等顺式作用元件,这些元件的突变造成启动子活性显著降低,推测其为调控SCP-2表达的重要元件。本研究基于NMR技术首次获得了鳞翅目昆虫棉铃虫SCP-2蛋白的三维结构,探讨了蛋白和胆固醇底物结合的功能位点,并克隆和分析了调控SCP-2表达的启动子序列。研究为利用该潜在靶位点开发新型高效杀虫剂提供了重要理论基础。