第一部分 MSCs移植HIBD后海马IL6释放与凋亡相关基因表达　　目的：探讨大鼠骨髓间充质干细胞移植新生大鼠缺氧缺血性脑损伤过程中白介素6与脑细胞凋亡的关系。　　方法：采用Rice法，大鼠生后7天造模，造模之后24小时内，腹腔注射1~1.5×106 MSCs；将55只大鼠随机分为三组，假手术组（sham）20只，模型组（HIBD）22只，干细胞组（MSCs）10只，在造模后一月时，采用水迷宫测试学习记忆能力；在造模后3天、7天和14天分别取三组海马组织做Realtime PCR、Western Blotting以及免疫荧光检测IL6，Bax和Bcl-2的表达。　　结果：　　1水迷宫测试：第1天可视化训练发现，三组间寻找平台的时间和寻找平台的距离无组间差异，可以排除造模的影响；第2-6天寻找平台的时间和寻找平台跑的距离显著低于sham组，MSCs组寻找平台的时间和寻找平台跑的距离曲线位于sham组和HIBD组之间，提示MSCs移植对 HIBD大鼠的学习记忆能力有一定改善；第7天时，在目标象限穿梭平台的次数显示 HIBD组低于 sham组，具有统计学意义，而MSCs组穿梭平台次数比HIBD组多但两者之间没有统计学差异。　　2分子生物学检测：⑴ IL6 mRNA表达在各个时间点三组间表达情况均不同，在造模后3d时，三组间IL6 mRNA表达无明显差异，而在蛋白水平，HIBD组IL6较其他两组增加；在造模后7d时，在mRNA水平和蛋白水平，MSCs组IL6较sham组和HIBD组都明显升高，而此时，HIBD组IL6与sham组相当；在造模后14d时，三组间IL6在mRNA和蛋白水平无明显差异；⑵Bax在3d和14d时，在mRNA水平，三组间没有差异，只有在7d时， HIBD组Bax表达明显高于sham组，而 MSCs组明显低于 HIBD组；在蛋白水平，HIBD组 Bax在3个时间点都高于sham组，在3d时，MSCs组Bax与HIBD组无明显变化，但在7d和14d时，MSCs组Bax较HIBD组明显降低；⑶在mRNA水平，在三个时间点三组间Bcl-2均无差异；在蛋白水平，在3d和14d时，MSCs组较HIBD组有一定增加，但没有统计学差异，在7d时， HIBD组较sham组明显降低，而MSCs组与HIBD组没有明显差异。　　3.形态学：⑴组织形态观察，水迷宫测试后随机取大脑灌注标本并拍照发现，sham组大脑外观没有局灶性坏死区域，但HIBD组可见损伤侧大脑有明显的坏死区，呈现与周围不同的白色区域，而 MSCs组损伤侧坏死区较HIBD组明显缩小；⑵免疫荧光显示：造模后第3、7d时，HIBD组海马CA1和CA2-3区与sham组的IL6有少量表达，MSCs组海马CA1、CA2-3区出现大量表达；3d时三组的Bax表达没有明显变化，7天时HIBD组较sham组明显增高，而MSCs组较HIBD组有所降低。　　结论： HIBD造模后海马损伤具有时间阶段性，在急性损伤第3天，是以炎症为主损伤，受损海马产生大量IL6，起到炎症损伤作用， MSCs移植使海马IL6表达降低，可能在此时起到调节免疫和抗炎作用；而损伤后第7天，随着时间推移，HIBD炎症反应逐渐平稳， MSCs移植后海马高表达IL6，而Bax表达降低，IL6可能通过抗脑细胞凋亡而促进损伤脑修复。　　第二部分过表达IL6重组腺病毒载体的构建及鉴定　　目的：构建携带特异表达大鼠白介素-6（interleukin-6，IL6）的重组腺病毒，为研究体外过表达IL6对PC12细胞凋亡作用奠定基础。　　方法：以大鼠骨髓间充质干细胞的mRNA为模板，经PCR获得目的基因IL6，将其定向克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrace-TOX中，构建重组腺病毒质粒 pAdTrace-IL6，并在 BJ5183菌中与骨架质粒pAdEasy-1重组获得腺病毒载体 pAd-IL6,PacⅠ酶切后转染 HEK293T细胞包装成重组腺病毒。腺病毒Ad-IL6感染PC12细胞，Realtime PCR和Western Blotting检测IL6表达。　　结果：PCR电泳及酶切鉴定证实目的基因正确克隆至腺病毒载体中，其基因序列与Genbank报道一致；Realtime PCR和Western Blotting结果均显示，Ad-IL6腺病毒颗粒感染PC12细胞后，IL6表达水平较对照组Ad-RFP明显增高。　　结论：成功构建了特异性表达大鼠 IL6基因的重组腺病毒载体Ad-IL6，并获得了具有感染能力的腺病毒，感染真核细胞后可高表达IL6，为进一步研究IL6功能及其在多种疾病中的免疫调节机制提供重要分子手段。　　第三部分 IL6对缺氧缺糖损伤PC12细胞凋亡相关基因的作用　　目的：了解IL6对缺氧缺糖损伤PC12细胞抗凋亡作用。　　方法：利用PC12细胞，模拟海马区神经细胞，利用缺氧缺糖损伤（oxygen and glucose-deprivation, OGD）细胞模型模拟HIBD；从细胞形态学、凋亡率和线粒体膜电位（ mitochondrial membrane potency,MMP）检测PC12细胞凋亡情况；利用腺病毒Ad-IL6感染PC12并且以空载体病毒Ad-RFP作为对照，检测过表达IL6对凋亡的影响。　　结果：　　1.PC12 OGD建模：⑴形态学，在光学显微镜下发现经OGD处理的PC12细胞形态多样、胞体不清晰、胞核不完整、且不易观察到，细胞似被挤压回缩，细胞聚集拥簇成团状呈菊花样、有空隙，残存有少许正常细胞，培养液中浮有坏死细胞残体，而正常细胞呈现圆形或者椭圆形、胞体清晰、胞核完整清晰、透亮，镜下细胞排列分布均匀，无聚集现象，细胞与细胞之间连接紧密均匀，无漂浮等现象；⑵OGD未处理组和处理组的凋亡率和MMP，未处理组的凋亡率是8.96±0.50， OGD处理组的凋亡率是45.35±3.98，两者具有显著性差异（P=0.0119）；未处理组的MMP是5.67±0.76，OGD处理组的MMP是37.75±4.78，两者具有统计学差异（P=0.0220）。⑶ PC12细胞在 OGD处理之后， Bax表达较control组高，而Bcl-2表达较control组低。　　2.Ad-IL6和Ad-RFP感染PC12后效果鉴定：⑴两种腺病毒在同等条件下，感染PC1236小时之后，两种腺病毒在荧光表达量是相当的；⑵流式检测两种腺病毒感染 PC12后凋亡率和 MMP，Ad-RFP组的凋亡率是14.25±0.4864，Ad-IL6组的凋亡率是11.43±1.635，两组间没有统计学差异（P=0.1737）；Ad-RFP组的MMP是18.82±3.831，Ad-IL6组的MMP是20.09±1.548，两组间没有统计学差异(P=0.7865)，提示两种病毒因感染造成PC12损伤是相当的。　　3.Ad-IL6和Ad-RFP感染PC12后经OGD处理，发现⑴细胞凋亡率， Ad-RFP组的凋亡率是41.89±3.997, Ad-IL6组的凋亡率是27.89±2.185，两组间存在明显的统计学差异（P=0.0277）⑵细胞MMP， Ad-RFP组的MMP是43.13±3.749，Ad-IL6组的MMP是31.25±1.780，两组间存在明显统计学差异（P=0.0242）⑶Ad-IL6组的IL6在mRNA和蛋白水平均高于Ad-RFP组，Ad-IL6组Bax在mRNA和蛋白水平均低于于Ad-RFP组，但Bcl-2表达两组间没有差异。　　结论：　　1. Ad-IL6感染PC12与对照组相比较可以模拟过表达IL6的影响，并排除病毒自身生物学影响；　　2.在OGD损伤模型中，IL6具有抗凋亡作用，这一作用可能主要是通过抑制Bax表达而发挥作用，对Bcl-2无明显影响（有促进Bcl-2表达趋势，但无统计学影响）。