衰老过程中癌基因KrasG12D的活化对ALT肿瘤发生作用的研究

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原癌基因ras突变会使抑癌基因p53应激,引发下游一系列衰老凋亡反应。当p53被抑制或发生突变时,失去对ras的正常监控,细胞过度增殖引发肿瘤。某些p53突变使其获得癌基因潜能,与ras突变共同作用更加容易发生肿瘤,恶性程度也更高。某些肿瘤依靠端粒延长替代机制(Alternative lengthening of telomere, ALT)维持端粒长度,保证细胞无限分裂,这种不依靠端粒酶活性的肿瘤统称为ALT肿瘤,ALT肿瘤大部分为间质来源。有研究显示p53部分缺失能够使端粒酶缺失(mTR-/")的小鼠自发瘤中上皮来源的肿瘤比例大幅增加,即发生了间充质向上皮的转变(mesenechymal-epithelial transition, MET).作为与p53关系密切的癌基因ras,其活化对于ALT肿瘤发生起到什么作用尚不清楚。因此,我们拟将最常见的ras突变KrasG12D引入mTR-/-原代细胞及p53正常的ALT肿瘤细胞中,观察这些细胞发生的变化。本实验应用定点突变技术构建pAcGFP1-N1-KrasG12D突变表达载体,分别转染三种间质来源细胞nTRv-/-(G3)MEF, WT-MEF以及SCID666B-1+p21siRNA。其中mTR-/-(G3)MEF细胞是繁殖到第三代的端粒酶敲除小鼠胚胎成纤维细胞,SCID666B-l+p21siRNA细胞是通过RNA干扰技术敲低P21表达而p53正常的ALT肿瘤细胞,WT-MEF细胞是野生型小鼠胚胎成纤维细胞主要作为对照组细胞使用。成功转染后G418筛选获得稳定表达细胞株,对其进行Western blotting,实时荧光定量PCR,衰老染色,Ki67染色,细胞成克隆试验等一系列的实验。我们发现:将KrasG12D转入mTR-/-(G3) MEF和WT-MEF细胞中,P53表达量升高,出现衰老表型(衰老阳性率:88.1%VS59.4%);相较于WT-MEF细胞,部分mTR-/-(G3) MEF细胞中出现空泡;将KrasG12D转入SCID666B-1+p21siRNA细胞中,相关间质细胞标志蛋白(Snail, N-cadherin等)mRNA水平升高,细胞没有发生MET现象;转入Kras-G12D后SCID666B-1+p21siRNA增殖能力增强(Ki67染色阳性率:94.03%vs90.3%;克隆形成率:7.75%vs3.75%)。以上结果说明:在小鼠细胞水平,癌基因KrasG12D的活化会导致端粒酶缺失的原代细胞迅速衰老,可能由于端粒酶的缺失而比正常原代细胞更加严重;而在小鼠ALT肿瘤细胞中,ras突变对于ALT肿瘤细胞的调控作用与p53缺失的情况有所不同,KrasG12D活化不能使细胞发生MET转变,细胞的增殖能力增强。本实验所有结果都是在小鼠细胞水平上得到的,与个体研究存在较大的差异。为此我们繁殖培养了KraSG12D*mTR-/-小鼠模型,目前已经繁殖到G3代小鼠,随着研究的深入,希望能够在小鼠个体水平获得相应结果。
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