肺癌是世界范围内发病率和死亡率都较高的恶性肿瘤。尽管目前有了更多的治疗手段,但晚期肺癌的5年生存率依旧不足5%,因此探索新型治疗模式尤为重要。分子靶向治疗是近十余年来兴起的治疗手段,自从表皮生长因子受体(EGFR)突变作为驱动基因被研究以来,针对EGFR通路的探索已成为肺癌精准治疗的重点。以吉非替尼(Gefitinib,易瑞沙,Iressa,ZD1839)和厄洛替尼(Erlitinib)为突出代表的EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)已广泛用于EGFR敏感突变的晚期或转移性非小细胞肺癌(Non small cell lung cancer,NSCLC),然而多项临床研究显示,大多数患者会在9-13个月后出现耐药现象。这些现象可能与EGFR基因型异质性有关,肺癌的异质性是指同一患者的不同瘤灶、同一瘤灶的不同部分以及同一瘤灶治疗前后EGFR突变状态都有可能不一致。无论是原发性耐药还是获得性耐药,都成为当今肺癌靶向治疗的热点和难点,如何克服耐药这一问题是研究获得突破性进展的关键所在。当出现EGFR-TKI耐药时,肺癌细胞的凋亡就受到抑制,同时凋亡通路中两个非常重要的分子BIM和FOXO-3a的表达就会降低。在肿瘤治疗中,BIM作为潜在的靶基因,成为研究者关注的焦点之一,BIM的表达上调会对肿瘤细胞的凋亡产生影响。近几年的研究表明接受EGFR-TKI吉非替尼治疗的NSCLC患者的效果与其体内BIM和FOXO-3a的表达有关。免疫细胞通过免疫应答抑制或杀伤肿瘤细胞,对于临床上其他手段不能彻底清除癌细胞的状况,其抑制效应是肿瘤治疗重要的补充手段。免疫治疗对肿瘤患者的毒副作用小,能够延长患者的生存时间并提高患者的生存质量,为肺癌的治疗提供了新的方向,在肿瘤治疗领域,其地位日趋重要。肿瘤免疫微环境影响着抗肿瘤免疫反应,通过分泌诸多信号因子以及与肿瘤细胞直接接触影响免疫反应。细胞因子决定着肿瘤局部免疫微环境,通过调节T细胞相关细胞因子的状态,可调节肿瘤免疫微环境的状态。已经得到证实的是,肿瘤局部是肿瘤细胞和宿主免疫系统直接互相作用的场所,细胞因子在肿瘤局部免疫微环境中起非常关键的作用。有研究指出,细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-induced killer cells,CIK)能够分泌IFN-γ使得A549/DDP细胞里的谷胱甘肽硫转移酶-7(GST-7)下调,从而逆转顺铂(DDP)耐药,这提示了肿瘤免疫微环境的细胞因子与肺癌耐药机制间存在关联,但免疫微环境对耐药现象有何影响尚未完全阐明,免疫微环境对EGFR-TKI抑制肺癌细胞是否有影响这一问题有待回答。本课题以肺癌细胞(EGFR-TKI敏感型细胞株、野生型细胞株、EGFR-TKI不敏感型细胞株、异质肺癌细胞群)为对象,分别从体外细胞实验和裸鼠荷瘤体内实验两个层面,针对免疫微环境对EGFR-TKI抑制异质肺癌细胞的影响及其机制进行了初步探讨,以期为针对肺癌EGFR-TKI治疗中延缓或克服EGFR-TKI耐药提供理论基础。【目的】研究免疫微环境(特异性DC-CIK及其分泌上清)对EGFR-TKI敏感型肺癌细胞、野生型肺癌细胞、EGFR-TKI不敏感型肺癌细胞、异质肺癌细胞群的作用;初步探讨免疫微环境对EGFR-TKI吉非替尼抑制EGFR-TKI敏感型肺癌细胞、野生型肺癌细胞、EGFR-TKI不敏感型肺癌细胞以及异质肺癌细胞群的影响及机制。【方法】第一部分:构建对肺癌细胞有靶向作用的DC-CIK。用流式细胞术对对照组DC-CIK和特异性DC-CIK进行细胞表型鉴定,用ELISA法检测对照组DC-CIK上清和特异性DC-CIK上清中IFN-γ、TNF-α、IL-2的水平。用光镜、扫描电镜、透射电镜、HE染色观察特异性DC-CIK细胞对肺癌细胞的作用及影响。第二部分:(1)光镜下观察EGFR-TKI吉非替尼、特异性DC-CIK上清及二者联合分别对三种肺癌细胞(EGFR-TKI敏感型Hcc827、野生型H292、EGFR-TKI不敏感型A549)的影响,MTT实验检测EGFR-TKI吉非替尼、特异性DC-CIK上清以及二者联合分别对三种肺癌细胞(Hcc827、H292、A549)抑制效应。(2)用实时定量PCR、Western Blot检测分别经过EGFR-TKI吉非替尼、特异性DC-CIK上清及二者联合作用处理的肺癌细胞(Hcc827、H292、A549)中凋亡通路相关信号BIM、FOXO-3a的表达。(3)用裸鼠移植瘤实验分别检测EGFR-TKI吉非替尼、特异性DC-CIK上清以及二者联合对肺癌的抑制效果,通过测量体重、瘤重、脾重、瘤体大小并计算瘤体增长率和瘤重体重比,进而比较三种处理方法的效果;实时定量PCR检测凋亡相关信号BIM、FOXO-3a在不同处理组瘤体组织内的表达;免疫组织化学法检测Caspase-3、Ki67在不同处理组瘤体组织内的表达。第三部分:(1)MTT实验检测EGFR-TKI吉非替尼、特异性DC-CIK上清以及二者联合对异质肺癌细胞群(野生型H292+EGFR-TKI不敏感型A549、野生型H292+EGFR-TKI敏感型Hcc827)的抑制作用。MTT实验检测不同浓度的吉非替尼对H292细胞(用A549细胞上清培养到第5代、用Hcc827细胞上清培养到第10代)与野生型H292细胞的抑制作用。(2)实时定量PCR检测在EGFR-TKI吉非替尼、特异性DC-CIK上清以及二者联合这三种处理的异质肺癌细胞群(H292+A549、H292+Hcc827)中凋亡通路相关信号BIM、FOXO-3a的表达。(3)通过异质肺癌细胞群(H292+A549)裸鼠移植瘤实验比较EGFR-TKI吉非替尼、特异性DC-CIK上清以及二者联合对异质肺癌的治疗效果,通过测量瘤重、瘤体大小,计算其增长率和瘤重体重比,进行比较三种处理方法的效果;实时定量PCR检测凋亡通路相关信号BIM、FOXO-3a在不同治疗组瘤体组织内的表达,免疫组织化学法检测Caspase-3、Ki67在瘤体组织内的表达。【结果】第一部分:流式细胞术结果显示特异性DC-CIK中CD3+CD8+,CD3+CD56+亚群比例比对照组DC-CIK显著增高;ELISA实验得知特异性DC-CIK分泌上清中的IFN-γ、TNF-α、IL-2水平比对照组DC-CIK上清明显增高;光镜、电镜下观察到特异性DC-CIK细胞对肿瘤细胞具有靶向抑制作用,肺癌细胞能被军团性杀伤至裂解。第二部分:形态学观察到特异性DC-CIK上清联合吉非替尼分别作用于肺癌细胞(Hcc827、H292、A549)时,肺癌细胞数量明显少于对照组、吉非替尼组、上清组;MTT实验得出二者联合对肺癌细胞(Hcc827、H292、A549)的抑制作用强于单独使用吉非替尼或单独使用特异性DC-CIK上清的作用;在这三种分别经过吉非替尼、上清及二者联合作用的肺癌细胞中,实时定量PCR、Western Blot检测到二者联合作用组中BIM、FOXO-3a的表达高于单独使用吉非替尼组或单独使用特异性DC-CIK上清组。裸鼠荷瘤实验结果得出在二者联合作用组的瘤体最小,其瘤体增长率最低,瘤重与体重的比值最小,说明二者联合作用的效果最好且副作用较小。实时定量PCR检测到二者联合作用组的瘤体中BIM、FOXO-3a的表达最高;免疫组化结果显示二者联合作用组中的凋亡标志物Caspase-3明显高于其他治疗组、增殖标志物Ki-67的表达明显低于其他治疗组。第三部分:MTT检测发现,在同样浓度的吉非替尼作用下经过A549细胞上清培养的H292细胞的耐药性高于野生型H292细胞的,经过Hcc827细胞上清培养的H292细胞的敏感性高于野生型H292细胞的。MTT实验得出特异性DC-CIK上清联合吉非替尼对异质肺癌细胞群(H292+A549、H292+Hcc827)的抑制率更高。实时定量PCR检测到二者联合作用组中BIM、FOXO-3a的表达为最高;异质肺癌细胞群(H292+A549)接种的裸鼠荷瘤实验结果显示在二者联合作用组的瘤体最小,瘤体增长率最低,瘤重与体重的比值最小,说明二者联合作用的效果最好且副作用较小。实时定量PCR检测到二者联合作用组的瘤体中BIM、FOXO-3a的表达最高;免疫组化结果显示二者联合作用组中的凋亡标志物Caspase-3的表达明显高于其他治疗组和增殖标志物Ki-67的表达明显低于其他治疗组。【结论】特异性DC-CIK能够靶向作用于肺癌细胞;特异性DC-CIK上清中IFN-γ、TNF-α、IL-2水平显著增高。免疫微环境对EGFR-TKI吉非替尼抑制肺癌细胞(EGFR-TKI敏感细胞Hcc827、野生型细胞H292、EGFR-TKI耐药细胞A549)以及异质肺癌细胞群(野生型细胞H292+EGFR-TKI不敏感型细胞A549、野生型细胞H292+EGFR-TKI敏感型细胞Hcc827)都具有协同抑制作用,且对荷瘤裸鼠体重影响较小,其机制可能与凋亡通路相关信号BIM、FOXO-3a、caspase-3的表达增高、ki67表达降低有关。基因突变型细胞及其条件培养基对野生型细胞对EGFR-TKI有一定的影响,其机制有待于进一步研究。