肿瘤的转移是肿瘤患者死亡的主要原因,其中肝脏是肿瘤转移的主要场所之一。目前研究肿瘤肝转移过程中关键分子和机制的方法多种多样,我们从功能学角度出发,利用CRISPR/Cas9基因敲除文库筛选小鼠体内调节肿瘤肝定植和转移灶形成的基因,推断肿瘤肝转移中哪些基因能发挥调节肿瘤肝转移的作用,并进一步验证基因功能和其发挥调节肿瘤转移的机制。小鼠脾注射肝转移模型是将肿瘤细胞悬液注射到脾内,通过脾血窦和门静脉系统汇入肝脏,从而使肿瘤细胞在肝脏定植并形成转移灶的肿瘤模型。其能模拟肿瘤细胞经门静脉及其分支播散到肝内其他地方形成转移灶的过程,是研究肿瘤细胞在远端肝血窦定植和存活能力的重要方法。对此我们利用CRISPR基因筛选技术,将包含CRISPR/Cas9基因敲除文库的慢病毒按一定比例感染小鼠肝癌细胞系Hepa1-6,再将Hepa1-6细胞悬液注入裸鼠脾血窦中构建脾注射肝转移模型,4周后观察裸鼠肝脏表面转移灶的分布。实验表明经CRISPR/Cas9文库敲除后Hepa1-6成瘤能力明显增强,因此我们推断由于某些基因的缺失使得Hepa1-6的肝内定植和转移能力增强。我们取部分转移灶进行测序分析,寻找出转移灶中存在46个靶向不同基因的sgRNA信息,再进一步对这些sgRNA所靶向的基因组片段进行测序分析,确定9个基因发生了移码突变。我们认为这9个基因经过CRISPR/Cas9系统靶向切割后发生移码突变丧失功能,从而使缺乏该基因的Hepa1-6细胞的肝内定植和转移能力增强,从而更易形成转移灶。我们对这些基因信息进行了初步分析,并从GEO数据库中寻找信息挖掘临床研究价值。我们发现ERMAP在肝癌与癌旁中存在表达差异,且ERMAP的表达量与肝癌患者术后无复发生存率呈正相关。我们再对临床门静脉癌栓,癌旁和癌组织的样本进行qPCR分析,发现ERMAP表达水平门静脉癌栓<癌<癌旁。这初步推测出ERMAP可能与抑制肿瘤肝转移有关。我们通过CRISPR/Cas9技术敲除了Hepa1-6细胞的Ermap基因,并验证其基因敲除效果。我们构建了小鼠脾注射肝转移模型后发现敲除Ermap后肿瘤细胞Hepa1-6的肝脏转移能力增强。为了知道Ermap发挥作用的机制,我们对Ermap基因信息进行检索,Ermap编码Ⅰ型跨膜蛋白,属于Butyrophilin家族成员。根据已有文献分析,Butyrophilin家族与B7家族类似,通过膜蛋白之间的相互作用参与免疫调节,但其结构和功能更具有多样性,目前为止其相互作用蛋白难以找到。ERMAP在胎肝等红色造血组织中选择性高表达,提示其参与红细胞生成,据推测其可能参与红细胞岛的形成,与巨噬细胞表面分子相结合发挥作用。我们合成了含有小鼠ermap胞外段的重组蛋白,其将小鼠ermap胞外段与人源抗体的Fc段融合形成可溶性的重组蛋白sErmap。流式细胞术检测发现sErmap有且只有同肝脏固有巨噬细胞Kupffer细胞结合,所以初步认为ermap通过同Kupffer细胞表面分子结合发挥抑癌作用。为了验证Kupffer细胞在Ermap发挥功能中起重要作用,我们用巨噬细胞清除剂去除小鼠体内巨噬细胞后再构建小鼠脾注射肝转移模型,结果去除巨噬细胞后Ermap的敲除与否并不影响肿瘤细胞的肝脏转移能力,这指示Kupffer细胞在其中发挥关键作用。Kupffer细胞作为肝血窦内的巨噬细胞,其主要功能是清理进入肝血窦内的异常细胞和微生物,起肝血窦清道夫的角色。因此作为效应细胞,我们推测Ermap能调节Kupffer细胞吞噬进入肝血窦中的肿瘤细胞从而抑制肿瘤细胞在肝脏的定植和生长。体外共培养Hepa1-6细胞和Kupffer细胞实验表明Kupffer细胞能吞噬Hepa1-6细胞,且敲除Ermap基因后其吞噬效果降低。因此我们认为ermap促进Kupffer细胞对肿瘤细胞的吞噬作用。综上所述,肝脏固有巨噬细胞Kupffer作为肝脏天然免疫的重要组成部分,能识别和吞噬进入肝血窦定植和转移的肿瘤细胞,而Ermap能促进Kupffer细胞识别和清除肿瘤细胞,这拓展了目前对Kupffer细胞抑制肿瘤细胞转移的研究,也为寻找临床寻找新的治疗靶点提供思路。