表皮干细胞(keratinocyte stem cell，KSC)具有强大的增殖再生能力，是表皮中各类细胞的起源细胞，在皮肤更新、伤口愈合、肿瘤形成等方面发挥着重要的作用。对表皮干细胞生物学特性的深入研究具有重要的意义。由于表皮干细胞数量少，而且在体外很容易分化而失去原来的生物学特性，所以干细胞的定位、分离培养及分化特性都是干细胞研究的重要课题。目的：1、观察不同来源的皮肤中表皮干细胞(KSC)的定位分布情况，并比较不同年龄的皮肤、正常皮肤与疤痕皮肤中KSC的分布及含量差异。2、研究干细胞的分离筛选方法，3、研究干细胞体外培养方法、条件，不同来源的滋养细胞的促干细胞克隆形成及生长的作用；4、研究干细胞在体外培养条件下的生长、分化特性。 方法：1. 取不同来源的皮肤(成人、胎儿、疤痕)，观察干细胞分子标志integrin(整合素)β1及终末分化标志involucrin(外皮蛋白)的表达情况；2. 原代表皮细胞培养：由包皮消化获得表皮细胞并传代培养。3. 滋养细胞的制备：用丝裂霉素C处理成纤维细胞，完全抑制其分裂增殖能力。4. 低密度单克隆培养：表皮细胞以低密度接种于滋养层上，培养12天后计算克隆形成率。将所含细胞数大于50、肉眼直径大于0.4mm的单个克隆挑取出来，分散成单细胞后接种培养，若一个克隆中95%以上的细胞能再次形成细胞数大于50的克隆，则该克隆为干细胞克隆，予继续传代培养。5. IV型胶原快速粘附法筛选表皮干细胞：将在20分钟以内粘附于胶原上的表皮细胞作为干细胞培养，12天后计算克隆形成率。以未加胶原粘附筛选的表皮细胞作为对照。6. KSC克隆的传代培养：将以低密度单克隆筛选法获得的干细胞克隆，以两种不同的方法分别进行传代培养。一种方法是每次传代时只挑取其中细胞数大于50、肉眼直径大于0.4mm的单个克隆进行传代培养；另一种方法是将KSC克隆的所有子代细胞混合消化成单细胞，低密度传代培养，12天后计算克隆形成率及免疫组化染色(抗integrinβ1及抗involucrin)，共观察5代。同时分别以3T3细胞、胎儿及小儿成纤维细胞作为滋养细胞，比较其促干细胞克隆形成及生长的作用。主要结果和结论：1. 不同来源的皮肤中干细胞的分布及含量差异：(1).正常成人皮肤中，干细胞特异性标志integrinβ1强阳性部位在真皮乳头尖上，散在或成团分布(干细胞巢)；在毛<WP=7>囊中位于其外跟鞘的膨大部分及球部；而在无毛的皮肤如手掌中则位于网状嵴的顶部；(2).胎儿皮肤中，基底细胞普遍为integrinβ1阳性细胞，呈多层排列，有干细胞巢，平均染色荧光强度显著高于于成人皮肤。说明胎儿皮肤中干细胞的含量可能较成人丰富；(3). 疤痕皮肤存在着明显的KSC分布异常，其基底层呈直线状，部分细胞染色阳性，干细胞呈单层分布，无“干细胞巢”。基底层的荧光强度曲线波动幅度较小，无正常皮肤所具有的典型的“M”形曲线特征。此外，疤痕皮肤平均荧光强度显著低于正常皮肤，说明疤痕皮肤中KSC的含量可能少于正常皮肤中KSC的量；(4). 成人疤痕皮肤中存在干细胞的增殖与分化异常。表皮细胞刚离开基底层即开始表达involucrin，与正常成人皮肤相比，疤痕表皮细胞提前进入终末分化。2. 表皮细胞生长特性：表皮细胞在体外呈复层生长，表现出迅速分化及生长加速的趋势。3. 原代表皮细胞克隆形成率(colony forming efficiency ，CFE)为5-10%。4. 胶原快速粘附法筛选干细胞的结果：与对照组相比，胶原组CFE显著升高，说明这是一种有效的筛选KSC的方法，但其CFE仅为16.2%-19.5%，另外80%以上的细胞不是克隆形成细胞(KSC)。表明此法是一种粗筛法，筛选的KSC细胞中有大量的TA细胞混杂。 5. KSC单克隆细胞传代培养的克隆再形成率：一个干细胞克隆分散成单细胞后接种，其克隆再形成率(CFE)为96.3%，每次传代时只挑取单个大的克隆接种培养，其CFE仍能保持在95%以上。而将所有子代细胞混合消化后传代培养，其总的CFE会逐渐下降，混合传代培养5代 ，其CFE分别为48.2%、37.2、33.4%、28.6%、27.4%。可见在体外培养条件下KSC克隆细胞逐渐分化，终末分化细胞逐渐增多，总的克隆形成率逐渐降低，但仍保留相当比例的克隆形成细胞。 6. KSC的分化情况：KSC传代培养后子代细胞中可见三种不同分化状态的克隆混合生长。其中干细胞克隆保留了干细胞特性，克隆中绝大部分细胞未分化(integrinβ1阳性)，可以持续传代，并进一步增殖分化出所有三种类型的克隆；短暂增殖克隆具有短期的分裂增殖能力，部分细胞发生终末分化，只能分化出终末分化克隆，不能传代培养；而终末分化克隆中所有细胞均已进入终末分化(全部表达involucrin)，不具有克隆再形成能力。KSC在体外培养、传代的过程中会逐渐分化，干细胞克隆所占的比例逐渐减少，分化克隆的比例逐渐增加，并相应的表现出KSC子代细胞的总的CFE渐次降低。但每次传代时若只是将干细胞克隆单独挑取出来分散成单细胞后传代培养，其CFE仍能保持在95%以上并能持续传代。7. 不同滋养细胞的比较：用胎儿或小儿成纤维细胞作为滋养细胞，其促干细胞克隆形成及生长的作用与3T3滋养细胞的作用相似。<WP=8>8．应用低密度单克隆筛选法可成功地分离?