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目的:构建Lnc RNA MEG3真核表达载体pcDNA3.1-MEG3,建立MEG3稳定表达细胞系,探讨Lnc RNA MEG3对乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响及机制。方法:从人乳腺组织中用MEG3特异性引物通过RT-PCR的方法扩增人MEG3片段,将MEG3片段插入到载体pcDNA3.1中,构建成Lnc RNA MEG3真核表达载体pcDNA3.1-MEG3,用PCR、酶切分析及测序鉴定的方法检测经过筛选之后得到的阳性重组体pcDNA3.1-MEG3,经脂质体介导转染MCF-7细胞,经G418筛选并扩增出阳性克隆后,用RT-PCR鉴定其在真核细胞中的表达;用MTT检测MEG3对MCF-7细胞增殖活性的影响,用Hoechst33258染色法、流式细胞术检测MEG3对MCF-7细胞凋亡的影响;在稳定转染MEG3的MCF-7细胞中加入NF-κB信号通路激动剂TNFα以及Bcl-2抑制剂TW37处理,用Western blot检测MEG3对NF-κB P65、NF-κB P50、Bcl-2和Caspase3蛋白的影响,分析NF-κB P65与NF-κB P50核移位的变化情况。结果:一个分子大小约为1600bp的片段从人乳腺组织中被扩增出来,经过限制性双酶切、链接获得重组子pcDNA3.1-MEG3,琼脂糖凝胶电泳显示重组子中插入片段为1600bp左右,与预期MEG3分子大小相符;对重组质粒进行dna的测序,结果显示插入质粒的meg3的核酸序列正确无误,无读码框移位现象;用脂质体将重组pcdna3.1-meg3质粒转染mcf-7细胞,获得重组的mcf-7细胞,rt-pcr结果显示meg3在mcf-7细胞中稳定表达;mtt法结果显示:与mcf-7细胞(mcf-7细胞)和转染空载体的mcf-7细胞(mcf-7-c细胞)比较,稳定转染meg3的mcf-7细胞(mcf-7-m细胞)增殖活性降低(p<0.01),nf-κb激动剂tnfα预处理,mcf-7-m细胞增殖活性增强(p<0.01),用nf-κb激动剂tnfα和bcl-2抑制剂tw37联合预处理的mcf-7-m细胞比单用tnfα处理的mcf-7-m细胞增殖活性降低(p<0.01);hoechst33258染色法和流式细胞术检测结果显示:与mcf-7细胞组和mcf-7-c细胞组相比,mcf-7-m细胞组凋亡率明显升高(p<0.01),tnfα预处理的mcf-7-m细胞比mcf-7-m细胞的细胞凋亡率明显降低(p<0.01),tnfα+tw37联合预处理的mcf-7-m细胞比单用tnfα处理的mcf-7-m细胞的凋亡率明显升高(p<0.01);蛋白迹法结果显示:mcf-7-m细胞i-κbα磷酸化水平降低(p<0.05),tnfα诱导mcf-7-m细胞i-κbα蛋白磷酸化。mcf-7-m细胞nf-κbp65、nf-κbp50以及bcl-2蛋白表达明显降低(p<0.01),caspase3蛋白表达明显升高(p<0.01),tnfα可诱导mcf-7-m细胞nf-κbp65、nf-κbp50和bcl-2蛋白的表达,促进nf-κbp65、nf-κbp50的核转位,抑制caspase3蛋白的表达,tw37可抑制mcf-7-m细胞bcl-2蛋白的表达,诱导caspase3蛋白的表达。结论:(1)成功构建了MEG3真核表达载体pc DNA3.1-MEG3,建立了MEG3稳定表达细胞系——MCF-7-M细胞。(2)Lnc RNA MEG3通过抑制MCF-7细胞I-κBα蛋白的磷酸化和NF-κB P65、NF-κB P50的核转位,下调MCF-7细胞Bcl-2的表达,上调MCF-7细胞Caspase3的表达诱导细胞凋亡。