研究背景和目的结直肠癌是一种严重威胁人类健康的恶性肿瘤,在我国发病率和死亡率均位居前五。近年来,随着国民生活水平的提高,尤其是膳食结构的变化,结直肠癌的发病率有逐年上升的趋势,而转移是导致患者复发和不良预后的重要原因,临床上有一半以上的病人确诊时已有远处转移。虽然有新型化疗药物和治疗方案应用于临床,转移性结直肠癌的五年生存率仍不容乐观,Ⅳ期患者五年生存率不足10%。因此,阐明结直肠癌转移的分子机制,有望为临床预测、诊断和治疗提供新的思路。上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)是肿瘤转移的重要机制之一,通过下调上皮标志物E-钙粘蛋白(E-cadherin)等,上调间质标志物波形蛋白(Vimentin)等,使细胞失去上皮极性,获得更好的侵袭能力和运动能力,从而实现肿瘤的远处转移。转化生长因子p (TGFβ)是EMT的重要调节因子,通过Smad依赖和非依赖途径促进肿瘤EMT。因此,TGFβ/EMT网络可能是结直肠癌转移的关键机制。MicroRNA(miRNA)是一类长度介于19～25核苷酸的小分子RNA,占人类基因组的2%-5%,在细胞的增殖、分化、凋亡等生命活动中扮演重要角色。MicroRNA由Poly聚合酶II生成长度数百核苷酸的pri-miRNA,再通过Drosha等蛋白复合体剪切形成60～70核苷酸的pre-miRNA,经跨膜转运蛋白5转移至胞浆,由核酸内切酶Ⅲ Dicer剪切为成熟microRNA。研究证实microRNA与TGFβ/EMT有着密切联系。miR-187是近年来研究发现的一个新的肿瘤相关microRNA,在多种肿瘤包括卵巢癌、乳腺癌、肾透明细胞癌、前列腺癌中扮演着重要角色,但迄今为止,未见miR-187在结直肠癌中的相关报道。通过生物信息学筛选以及验证,我们发现miR-187是TGFβ的下游靶点,在抑制结直肠癌侵袭、转移和EMT方面发挥重要作用。我们证实miR-187的下游靶基因SOX4、NT5E、PTK6在TGFβ介导的EMT过程中发挥着重要作用,与结直肠癌病人的不良预后密切相关。因此,我们推测miR-187及其靶基因SOX4、NT5E、PTK6是TGFβ介导EMT的重要机制,在结直肠癌转移中起着至关重要的作用。本研究旨在探讨miR-187及其靶基因SOX4、NT5E、PTK6如何参与TGFβ介导EMT的分子机制,为将来选择性干预miR-187及其靶基因治疗转移性结直肠癌提供实验依据。研究方法1.miR-187在结直肠癌组织和细胞中的表达(1)通过对结直肠癌组织microRNA芯片进行分析,筛选出差异microRNAs,miR-187是其中的一种候选microRNA。(2)采用荧光定量RT-PCR检测35例结直肠癌及配对的正常黏膜组织,8株结直肠癌细胞株(HT29, HCT116, LS174T, RKO, SW480, SW620, SW480/M5, LOVO)和正常结肠上皮细胞NCM460中miR-187的表达。(3)通过对119例有完整随访资料的石蜡包埋组织进行原位杂交,检测miR-187的表达并分析其与临床病理学参数的关系。2.miR-187对结直肠癌细胞体内外生物学特性的影响(1)通过CCK8细胞增殖实验、Transwell细胞迁移实验和划痕实验,检测瞬时转染miR-187 mimics/inhibitor对结直肠癌细胞体外增殖、迁移和运动能力的影响。(2)利用慢病毒LV-miR-187构建稳定过表达细胞株,通过平板克隆形成实验、Transwell细胞迁移实验和划痕实验,检测稳定过表达miR-187对结直肠癌细胞体外增殖、迁移和运动能力的影响。(3)通过对裸鼠进行皮下成瘤及尾静脉注射实验,检测稳定过表达miR-187对结直肠癌细胞皮下成瘤及肺定植能力的影响。3.miR-187参与TGFβ介导的EMT的机制研究(1)观察瞬时转染miR-187 mimics/inhibitor后结直肠癌细胞形态的变化,利用Western Blot和免疫荧光检测EMT相关指标的改变。(2)通过基因芯片对SW480/LV-miR-187、SW480/LV-NC、RKO/LV-miR-187和RKO/LV-NC细胞进行基因表达谱分析,筛选差异倍数大于1.5倍的基因进行KEGG pathway分析,探索其与TGFβ信号通路的相关性。用TGFβ刺激细胞后进行荧光定量RT-PCR检测miR-187表达水平的变化。(3)将细胞分为TGFβ对照组、TGFβ处理组、TGFβ+mimics处理组,通过光镜观察细胞形态学变化,Transwell检测细胞迁移,Western Blot检测EMT相关指标以及Smad信号通路的变化。4.miR-187靶基因的筛选与鉴定(1)通过对SW480/LV-miR-187和RKO/LV-miR-187的基因芯片结果结合生物信息在线网站TargetScan、Pictar和]miRanda交集预测miR-187的靶基因。通过文献挖掘和荧光定量RT-PCR筛选出候选靶基因,双荧光素酶验证miR-187与候选靶基因直接作用。通过Western Blot和免疫荧光检测过表达miR-187后靶基因的变化。(2)将细胞分为TGFβ对照组、TGFβ处理组、TGFβ+mimics处理组,通过Western Blot检测靶基因的变化。(3)在SW480/LV-miR-187和RKO/LV-miR-187细胞中转入靶基因的ORF克隆载体,通过Transwell实验检测细胞迁移能力,Western Blot检测EMT相关指标以及Smad信号通路的变化。5.统计学分析采用SPSS19.0统计软件进行数据分析。MiR-187在新鲜配对结直肠癌组织中的表达采用配对样本Wilcoxon符号秩检验(Wilcoxon rank-sum test),转移组与非转移组中miR-187的表达采用独立样本Kruskal-Wallis检验(Kruskal-Wallis test); MiR-187的表达与临床病理参数之间的相关性采用卡方检验(Pearson’s chi-squared (x2) test);生存曲线采用Kaplan-Meier法绘制并进行Log-Rank检验比较生存曲线之间的统计学差异；荧光定量RT-PCTR实验、Transwell细胞迁移实验、划痕实验、平板克隆实验进行两组间的均数比较时,采用两独立样本的t检验,进行多组间的均数比较时采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),方差分析前先进行Levene法检测方差齐性,方差齐时多重比较使用LSD法(Least-significant Difference,最小方差法),方差不齐时使用Dunnett’s T3法。研究结果：1.miR-187在结直肠癌组织和细胞中的表达(1)miR-187在结直肠癌组织和细胞中表达下调在GEO(Gene Expression Omnibus, GSE49246)对结直肠癌组织microRNA芯片进行分析,在40对结直肠癌组织中,与癌旁正常组织相比,有32对癌组织中miR-187表达下调。荧光定量RT-PCR结果显示,35对新鲜的结直肠癌组织与配对正常组织相比,miR-187在癌组织中表达低于正常配对组织(P<0.05),并且在有淋巴结转移的癌组织中,与未检测到有淋巴结转移的癌组织相比,miR-187的表达更低(P=0.001)。与正常结肠上皮细胞NCM460相比,miR-187在结直肠癌细胞中的表达下调(P<0.05)。(2)miR-187与患者不良预后相关通过对119例有完整随访资料的结直肠癌石蜡包埋组织进行原位杂交检测miR-187的表达,并结合患者临床资料进行临床病理学参数统计发现,患者的性别、年龄、肿瘤的位置和大小、分化程度、及TNM分期与miR-187的表达均无关系(P=0.164；P=0.476:P=0.744；P=0.197;P=0.575；P=0.379;P=0.272；P=0.771).生存分析表明miR-187低表达与患者不良预后密切相关(P=0.016),采用COX比例风险模型评估临床病理学参数与患者总生存期的关系发现,患者总生存期与肿瘤分化程度、N及M分期、miR-187的表达有关(P<0.005；P<0.01；P=0.001,P<0.05),差异有统计学意义。以上实验说明,miR-187在结直肠癌中低表达,并与患者不良预后相关,有望作为独立预测指标判断结直肠癌患者的预后。2.miR-187抑制结直肠癌细胞体内外增殖、迁移、运动和体内肺定植能力(1)miR-187抑制结直肠癌细胞体外增殖、迁移和运动能力CCK8细胞增殖实验结果显示,在SW480.RKO和SW620细胞中瞬时转染miR-187 mimics后,与对照组control相比,细胞增殖能力明显受到抑制(F=198.508,P<0.001; F=630.401,P<0.001；F=3535.860,P<0.001),在SW480和HCT116细胞中瞬时转染miR-187 inhibitor后,与对照组control相比,细胞的增殖能力明显增强(F=198.508,P<0.001;F=191.249,P<0.001).Transwell细胞迁移实验结果显示,在SW480.RKO和SW620细胞中瞬时转染miR-187mimics后,与对照组control相比,细胞的迁移能力明显受到抑制(t=-7.718,P<0.01;t=-7.448,P<0.05；t=-5.396,P<0.01),在SW480和HCT116细胞中瞬时转染miR-187 inhibitor后细胞的迁移能力明显增强(t=2.922,P<0.05；t=-4.509,P<0.05)。划痕实验结果显示,在SW480.RKO和SW620细胞中瞬时转染miR-187mimics后,与对照组control相比,细胞运动能力明显受到抑制(t=29.938,P<0.001;t=10.438,P<0.001；t=-11.786,P<0.001),在SW480和HCT116细胞中瞬时转染miR-187 inhibitor后,与对照组control相比,细胞的运动能力明显增强(t=10.532,P<0.001;t=5.227,P<0.01).利用慢病毒构建SW480/LV-miR-187和RKO/LV-miR-187稳定过表达细胞株,与对照组SW480/LV-NC和RKO/LV-NC相比,细胞克隆形成能力(t=7.904,P=0.001;t=9.107,P=0.001).迁移能力(t=-10.251, P<0.005; t=-4.025, P<0.05)和运动能力(t=-11.489, P<0.001; t=-15.461, P<0.001)均降低。(2)miR-187抑制结直肠癌细胞体内增殖和肺定植能力利用慢病毒构建SW480/LV-miR-187和RKO/LV-miR-187稳定过表达细胞,裸鼠皮下成瘤结果显示,与对照组SW480/LV-NC和RKO/LV-NC相比,SW480/LV-miR-187和RKO/LV-miR-187形成的皮下瘤的体积(P<0.05；P>0.05)明显小于对照组,重量也更轻(P<0.05; P>0.05), Ki-67阳性率也低于对照组(t=5.579, P<0.01; t=7.320, P<0.005);尾静脉注射实验结果显示,SW480/LV-miR-187和RKO/LV-miR-187稳定过表达细胞在小鼠肺内形成的定植灶更小,数目更少,裸鼠的生存期更长(P<0.05)。以上实验说明,miR-187抑制结直肠癌细胞体内外增殖、迁移、运动和肺定植能力。3. TGFβ调控miR-187激活Smad通路介导EMT的发生(1)miR-187抑制EMT的发生在SW620、RKO和SW480细胞中通过转染mimics过表达miR-187,在SW480、HCT116和NCM460细胞中通过转染inhibitor干扰miR-187,通过光镜观察发现过表达miR-187后细胞由梭行向圆形转变,伪足缩短、变小；干扰miR-187后,细胞由梭形变得更为细长,伪足也更长。同时Western Blot结果显示,过表达miR-187后EMT上皮标志物(E-cadherin, β-catenin, ZO-1)表达增加,间质标志物(N-cadherin, fibronectin, vimentin)表达降低；干扰miR-187后则结果相反。免疫荧光结果显示也得到同样的结果,过表达miR-187后EMT上皮标志物(E-cadherin, β-catenin)表达增加,间质标志物(vimentin)表达降低；干扰miR-187后则结果相反。(2)miR-187参与TGFβ/Smad通路通过对SW480/LV-miR-187和SW480/LV-NC、RKO/LV-miR-187和RKO/LV-NC送检基因芯片,对结果进行分析,筛选改变倍数大于1.5倍的差异基因共585个,通过KEGG pathway (http://www.kegg.jp/kegg/tool/map pathwayl.html)分析,发现miR-187参与调控TGFβ信号通路。筛选改变倍数大于2倍的差异基因做红绿热图,操作软件为MeV 4.4 software (http://www.tm4.org/mev.html)。筛选改变倍数大于1.5倍进行EMT标志物数据库分析,发现稳定过表达miR-187上调上皮标志物,下调间质标志物,提示miR-187可以抑制EMT。用TGFβ分别刺激SW480、HCT116、MDCK细胞Oh、24h、48h后进行荧光定量RT-PCR检测,结果显示对照组、TGFβ 24h处理组、TGFβ 48h处理组miR-187的表达具有显著差异(F=23.622, P=0.001; F=98.036, P<0.005; F=18.157,P<0.005),多重结果比较表明,与对照组相比,TGFP 24h处理组、TGFβ 48h处理组miR-187的表达水平降低(P<0.01, P<0.001; P=0.01, P<0.001; P<0.05,P=0.001),差异有统计学意义。在SW480、RKO和SW620细胞中通过瞬时转染mimics过表达miR-187, Western Blot结果显示,过表达miR-187后Smad信号通路被抑制；在SW480、HCT116和NCM460细胞中通过瞬时转染inhibitor干扰miR-187后,Smad信号通路被激活。对SW480、HCT116和MDCK细胞分别进行3种处理,TGFP对照组.TGFβ处理组.TGFP+mimics处理组,Transwell细胞迁移实验结果显示,TGFβ对照组、TGFβ处理组、TGFβ+mimics处理组穿出的细胞数目有显著差异(F=28.240, P=0.001; F=32.745, P=0.001; F=14.889,P=0.005),多重结果比较表明,与对照组相比,TGFβ处理组穿出的细胞数目明显增多(P<0.005；P<0.005；P<0.01)；与TGFP处理组相比,TGFβ+mimics处理组穿出的细胞数目明显减少(P<0.01;P<0.01；P<0.05),差异有统计学意义。同时,倒置显微镜观察细胞形态学发现,TGFβ处理组与TGFβ对照组相比细胞由梭形变得更为细长,TGFβ+mimics处理组与TGFβ处理组相比,细胞由梭形变为圆形。Western Blot结果显示TGFP处理48h后EMT上皮标志物(E-cadherin, β-catenin)表达降低,间质标志物(fibronectin, vimentin)表达增加,Smad信号通路活化,TGFβ 48h+mimics处理组与TGFβ 48h处理组相比,上皮标志物(E-cadherin, β-catenin)表达增加,间质标志物(fibronectin, vimentin)表达降低,Smad信号通路被抑制。4.miR-187靶向SOX4、NT5E、PTK6(1)miR-187相关靶基因的预测对SW480、RKO细胞miR-187基因芯片结果结合生物信息在线网站TargetScan、Pictar和miRanda取交集预测出114个miR-187的候选靶基因,对这114个基因进行基因本体分析及KEGG通路分析初步筛选出27个靶基因进行荧光定量RT-PCR检测,结果显示SOX4、NT5E、PTK6在过表达miR-187的细胞中下调(t=5.798, P<0.005; t=3.783, P<0.05; t=5.357; P<0.01).(2)miR-187靶基因的鉴定成功构建wt SOX4/NT5E/PTK63’UTR和mut SOX4/NT5E/PTK63’UTR双荧光素酶报告载体。将以上质粒与对照质粒psiCHECK-2分别与miR-187mimics共转染293T细胞后检测荧光素酶活性,结果显示psiCHECK-2+mimics荧光素酶相对活性分别为1.000±0.153,1.000±0.222,1.000±0.151;wtSOX4/NT5E/PTK63’UTR+mimics荧光素酶相对活性分别为0.634±0.054,0.456±0.032,0.627±0.015; mut SOX4/NT5E/PTK63’UTR+mimics荧光素酶相对活性分别为0.957±0.176,0.806±0.088,0.928±0.198,差异均具有统计学意义(F=6.306, P<0.05; F=11.737, P<0.01; F=9.080, P<0.05).对照质粒psiCHECK-2与突变质粒mut SOX4/NT5E/PTK63’UTR与miR-187共转染均没有改变荧光素酶的活性,表明miR-187与SOX4/NT5E/PTK63’UTR可特异性结合。Western Blot和免疫荧光结果显示,过表达miR-187后SOX4、NT5E、PTK6表达下调。(3)miR-187靶基因的功能与机制在SW480/LV-miR-187和RKO/LV-miR-187细胞中分别转入SOX4、NT5E、PTK6的ORF克隆载体,Transwell细胞迁移实验结果显示,Mock组、control组、mimics组、mimics+SOX4组、mimics+NT5E组、mimics+PTK6组细胞的迁移能力具有显著差异(F=29.368, P<0.001; F=44.690, P<0.001).多重结果比较表明,过表达miR-187使SW480和RKO细胞体外迁移能力降低(P<0.001；P<0.001),恢复靶基因SOX4、NT5E、PTK6的表达后SW480和RKO细胞体外迁移能力得到恢复(P=0.001, P<0.001, P<0.001; P<0.001, P<0.001, P<.001)。在SW480和RKO细胞中进行如下转染处理：mock、control、miR-187 mimics、miR-187 mimics+SOX4/NT5E/PTK6共转染,48h后收细胞进行Western Blot,结果显示单独转染miR-187 mimics后EMT上皮标志物(E-cadherin, β-catenin)表达增加,间质标志物(fibronectin, vimentin)表达降低,Smad信号通路被制；与单独转染miR-187 mimics相比,miR-187 mimics+SOX4/NT5E/PTK6共转染组EMT上皮标志物(E-cadherin, β-catenin)表达降低,间质标志物(fibronectin, vimentin)表达增加,Smad信号通路活化,miR-187抑制EMT及Smad通路的作用被部分逆转。结论1、miR-187在结直肠癌组织和细胞中低表达,与患者不良预后密切相关,初步推断miR-187在结直肠癌中扮演着抑癌基因的作用；2、miR-187抑制结直肠癌细胞体内外增殖、迁移、运动和肺定植能力；3、TGFβ调控miR-187激活Smad通路介导EMT；4、miR-187靶向SOX4、NT5E、PTK6抑制EMT和Smad通路。