金黄色葡萄球菌是人体皮肤和鼻腔的常见定植菌，同时也是引起临床感染的常见致病菌，既可引起局部化脓性感染，如疖、痈、毛囊炎、甲沟炎和外科切口、创伤等局部化脓性感染，也可引起肺炎、骨髓炎、脑膜炎、化脓性关节炎、心内膜炎及脓毒症、败血症等全身性感染。随着抗生素广泛应用于临床，金黄色葡萄球菌耐药菌株不断出现，并且呈现多重耐药性。金黄色葡萄球菌耐药性的获得，一方面可以通过细菌自身表型的改变、代谢通路的调整等，对抗生素产生适应性耐药（adaptive resistance），如金黄色葡萄球菌生物被膜的产生、形成小菌落、细胞壁增厚以及持留菌的产生都可以对抗生素产生较高的耐药性；另一方面，金黄色葡萄球菌可以通过水平转移等方式获得耐药基因，如金黄色葡萄球菌获得产生β-内酰胺酶基因后即可呈现对β-内酰胺类抗生素的耐药性。自1961年发现第一株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcusaureus, MRSA）以来，MRSA在临床的感染率和分离率不断增加，并且在世界范围内广泛传播，成为全球院内感染的首要病原菌。MRSA的耐药机制主要为细菌获得一耐药岛，该耐药岛上含有一个重组酶簇和一个耐药决定簇。在耐药决定簇上的mecA基因可以编码产生一种新的青霉素结合蛋白（penicillin binding protein,PBP），称为PBP2a，其转肽酶结构域（TPase domain）与β-内酰胺类抗生素的亲和力极低，当正常PBPs被抗菌药物结合而失去活性时，PBP2a能够代替其功能，继续肽聚糖合成，维持MRSA菌的生长和成活，呈现出高度耐药性。一般认为，在没有抗生素选择压力下，mecA基因的表达在转录水平是受到严格控制的。位于mecA基因的启动子上游有一对基因mecR1-mecI调控mecA的表达。耐药决定簇mecI所编码产生的MecI阻遏蛋白结合在mecA基因的启动子部位，使得mecA基因表达处于抑制状态，但是当生长环境中存在相关抗生素（如青霉素、头孢西丁等）时，抗生素一方面攻击正常PBPs的转肽酶功能域，使其失去活性而丧失合成细菌细胞壁的功能，另一方面可以作为诱导剂，与分布在细菌胞膜上的由mecR1基因编码的MecR1蛋白相结合，使其发生自裂解而发挥肽酶活性，分解结合在mecA启动子上的阻遏蛋白MecI,从而启动mecA的表达，产生PBP2a，代替PBP2的转肽酶活性，继续金黄色葡萄球菌肽聚糖的合成，维持MRSA耐药性。最新的研究显示在mecI基因的下游还有个mecR2基因，mecR2与mecR1-mecI组成了一个三组分系统调控mecA基因的转录，mecR2所编码的蛋白MecR2可以通过与MecI直接的相互作用，使得MecI稳定性下降，并最终导致MecI蛋白的钝化和降解。然而分子流行病学研究发现，在MRSA耐药岛上的耐药决定簇（mec complex）可由于插入序列（IS431，IS1272）的插入，导致mecR1或/和mecI基因被外源序列插入而失活，mecA表达不受限制，即有的金黄色葡萄球菌中耐药分子PBP2a处于持续组成型表达状态，并且，最新的研究表明，mecA的持续表达与金黄色葡萄球菌耐药水平无线性对应关系，即PBP2a的存在与MRSA的耐药性表现不是完全对应，MRSA的耐药性表现需要PBP2a存在，但并不是有PBP2a存在，金黄色葡萄球菌就一定表现出耐药性。Giannouli S等对金黄色葡萄球菌临床分离株进行了检测分析，发现菌株中存在mecA基因，且能正常表达，但这些菌株仍表现出对甲氧西林敏感，强烈提示PBP2a在介导金黄色葡萄球菌耐药性时还受着某些未知调控因素的影响。一般，一个蛋白质分子功能的发挥，基因水平的调控只是第一步，决定着相应的蛋白分子是否表达，而蛋白质分子表达后是否发挥出相应的生物学功能，还取决于蛋白质水平的影响因素，且这种调控可能是更直接的。在我们前期的工作中，我们以金黄色葡萄球菌PBP2a分子的转肽酶结构域为诱饵，通过细菌双杂交技术从耐药金黄色葡萄球菌N315基因组表达文库中筛选到一与PBP2a相互作用的小肽（40aa），体外pull-down实验证实该小肽能与PBP2a直接相互作用。生物信息学检索显示，该小肽为耐药金黄色葡萄球菌N315基因组上的一个未注释的新基因所编码，命名为pbpR。我们推测PBPR可能通过与PBP2a的直接相互作用从而在介导MRSA的耐药性中发挥重要作用。本论文第一部分，对我们课题组在MRSA流行病学研究过程中发现的一些可能为适应性耐药临床分离菌株进行深入研究，探讨MRSA菌对抗生素产生适应性耐药的可能机制。另外为了阐明PBPR与PBP2a介导的耐药性的关系，本文采用RT-PCR的方式证实pbpR基因在N315中是表达的；通过细菌双杂交技术证实PBPR全长蛋白（63aa）与PBP2a具有相互作用；利用基因敲除技术构建pbpR基因缺失突变株，检测突变株的耐药性变化，以明确PBPR对PBP2a介导耐药性的调控作用。研究内容和结果主要包括以下几个方面：1.金黄色葡萄球菌对阿米卡星适应性耐药研究（1）临床分离株CY001和CY002基因分型及生长特性研究：通过脉冲场凝胶电泳、多位点序列分析、金黄色葡萄球菌染色体盒mec元件分型，金黄色葡萄球菌表面蛋白A多变区分型等基因分型技术手段证实从同一个病人不同时期，分离自不同部位的MRSA菌CY001和CY002具有一致的基因分型；CY001和CY002具有相似的耐药谱，但是CY001对阿米卡星耐药（MIC64μg/ml），CY002对阿米卡星敏感（MIC8μg/ml）；PCR结果显示两株菌均不携带阿米卡星耐药基因；CY001在阿米卡星的压力下，生长曲线会发生滞后现象，考虑CY001对阿米卡星的耐药为适应性耐药。（2）临床分离株CY001和CY002细胞表型及相关基因表达变化研究：透射电子显微镜结果显示CY001在阿米卡星MIC压力下，细胞壁会增厚2倍左右，并且随着抗生素浓度增高，细胞壁增厚程度加剧，在细胞壁增厚的过程中，肽聚糖合成关键酶的编码基因pbpB表达明显上调,这就提示CY001对阿米卡星的耐药可能是通过细胞壁增厚的机制产生适应性耐药。并且在体外，通过梯度抗生素诱导实验，成功的从阿米卡星敏感菌株CY002中筛选到一株与耐药菌CY001相似的耐药菌，该诱导菌在抗生素压力下也会发生细胞壁增厚。（3）本部分研究显示细胞壁增厚是金黄色葡萄球菌对阿米卡星产生适应性耐药的可能机制。2. PBPR对PBP2a介导MRSA耐药性的调控作用研究（1） pbpR在转录水平表达的研究：RT-PCR实验中，我们用P2-R引物对RNA进行逆转录，而后进行PCR，可以扩增出大小为225bp的片段，此时检测的应为负链上的pbpR基因，这表明在RNA水平，pbpR基因是有表达的。（2） PBPR与PBP2a相互作用的验证：完整的pbpR基因克隆并构建到rPAC质粒上，后转化入含有诱饵质粒pBR-PBP2a的KS1细菌中，通过细菌双杂交技术验证PBPR与PBP2a的相互作用，结果显示完整的PBPR与PBP2a在细菌双杂交体系中具有相互作用。（3） pbpR基因敲除突变株的构建：以N315基因组DNA为模板，PCR分别扩增pbpR基因的上下游片段；同时以pSET16穿梭质粒DNA为模板，PCR扩增氯霉素抗性基因cat，在限制性内切酶和T4连接酶的作用下，分别将它们依次克隆到pYT3载体的多克隆位点上，形成靶基因敲除载体pYT3::pbpR。将敲除载体电转化至N315感受态细菌，筛选具有氯霉素抗性的N315菌落。通过PCR初筛和多重PCR复筛的方法获得pbpR基因敲除突变株。（4） pbpR基因缺失前后细菌耐药性的差异：我们通过琼脂稀释法及药敏纸片法测定pbpR基因敲除后N315对苯唑西林的耐药性。结果表明pbpR基因缺失会导致MRSAN315菌株对β-内酰胺类抗生素（如苯唑西林）的耐药性降低。综上所述，本课题实验证实细胞壁增厚可能是临床MRSA菌株对阿米卡星适应性耐药的机制。另外我们通过细菌双杂交技术成功地筛选到一与MRSA耐药主要因子PBP2a相互作用的分子PBPR，RT-PCR证实pbpR在转录水平有表达，并通过基因敲除技术获得了pbpR基因缺失突变株，药敏实验显示pbpR基因的缺失，MRSA N315菌株对苯唑西林的耐药性会降低。PBPR分子通过何种方式与PBP2a相互作用从而介导MRSA对β-内酰胺类抗生素耐药性的改变将是我们接下来重点关注的问题。本文研究结果揭示了临床分离菌株适应性耐药产生的可能原因；另一方面成功地筛选、鉴定了与MRSA耐药性有关的因子PBPR，阐明了PBPR可通过与PBP2a的相互作用介导并调控MRSA耐药性。以上研究为寻找控制MRSA感染的新途径奠定了理论基础