细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer，CIK）是将人体（自体或异体）外周血单个核细胞在体外经多种细胞因子刺激后活化增殖的一群异质性细胞群。它具有增殖能力强、杀瘤活性高、抗瘤谱广及不受MHC（majorhistocompatibility complex，MHC）限制性等特点。特别是对术后清除微小转移灶、防止扩散及复发，提高患者自身抗肿瘤免疫能力具有重要作用。CD28是表达于人类T细胞以及部分NK细胞表面的重要分子，T细胞的CD28作为受体分子与抗原提呈细胞（antigen presenting cell, APC）表达的B7分子结合介导T细胞活化所需的协同刺激信号，从而激发T细胞的增殖与发挥免疫效应。激发型的CD28抗体与CD28分子结合后可直接转导细胞活化信号，进而促进细胞的增殖与发挥免疫效应。本研究旨在自行制备鼠抗人激发型CD28单抗的基础上，联合不同细胞因子体外诱导CIK细胞，分析该法诱导的CIK的增殖能力、表型特征及对乳腺癌细胞株MCF-7的杀伤作用，以期寻找安全、高效扩增CIK的新方案。第一部分鼠抗人激发型CD28单克隆抗体的制备及鉴定目的：制备鼠抗人激发型CD28单克隆抗体并鉴定其生物学功能。方法：将已建株的分泌鼠抗人激发型CD28单克隆抗体的杂交瘤细胞大量体外扩增，采用体内诱生腹水法制备单抗并经Protein A亲和层析分离纯化。间接免疫荧光法鉴定单克隆抗体的效价，流式细胞术分析单克隆抗体对细胞膜型CD28分子的结合能力。结果：腹水形成率约为80%，腹水收获量为2ml/只。腹水经纯化后的抗体蛋白得率为1.5mg/ml。纯化抗体用于间接免疫荧光检测的用量为0.5g/5×105细胞。结论：制备的激发型CD28单克隆抗体能够良好地结合抗原分子。第二部分激发型CD28单抗参与诱导的CIK及其表型分析目的：研究激发型CD28单抗参与诱导的CIK的扩增能力及细胞表型特征方法：采用Ficoll分离法获取健康人外周血单个核细胞（PBMC），调整浓度为2×106/ml后，接种于24孔培养基，1ml/孔。按以下两组添加诱导剂：A、anti-CD3+IL-2+IFN-γ；B、anti-CD3+anti-CD28+IL-2+IFN-γ。诱导剂的终浓度anti-CD3为1μg/ml、anti-CD28为0.5μg/ml、IL-2为0.1万单位/ml、IFN-γ为100ng/ml。隔2-3日换液或扩瓶。于第7天经细胞计数计算各孔细胞数量；同时采用流式细胞术单标记法分析两组诱导方案下CIK表面CD4、CD8及CD56的表达，流式细胞术双标记法分析CIK表面CD4/CD25、CD8/CD25、CD4/FasL、CD8/FasL的表达。结果：培养至第7天，激发型CD28单抗组CIK的细胞总量平均为8.2×106/孔，明显高于对照组的2.8×106/孔,差异具有统计学意义（P<0.05）。单标记法的分析结果显示，激发型CD28单抗参与的CIK中CD4+T细胞、CD8+T细胞及CD56+细胞分别为68.4±6.1%、34.6±7.2%及15.1±3.9%，与对照组的52.5±3.6%、26.9±2.7%及7.7±1.2%比较均具有显著统计学差异（P<0.05）。双标记法的分析结果显示，激发型CD28单抗参与诱导的CIK细胞中CD4+FasL+T细胞、CD8+FasL+T细胞、CD4+CD25+T细胞及CD8+CD25+T细胞比例分别为36.6±4.7%、40.7±3.2%、60.1±5.3%及58.5±4.1%。与对照组的21.9±3.9%、24.3±5.1%、45.6±4.6%及44.6±3.4%比较均具有统计学意义（P<0.05）。结论：激发型CD28单抗可增强CIK的扩增能力及上调活化细胞膜型分子的表达。第三部分激发型CD28单抗参与诱导的CIK对乳腺癌细胞株MCF-7的杀伤作用目的：研究激发型CD28单抗参与诱导的CIK对乳腺癌细胞株MCF-7的杀伤效应。方法：按照上述方法诱导CIK，以其作为效应细胞，人乳腺癌细胞株MCF-7作为靶细胞，按效靶比20：1加入培养板，培养3天。用CCK-8掺入法检测杀伤活性，同时采用Annexin V/PI方法分析CIK对MCF-7的凋亡及死亡的影响。结果： CCK-8掺入法检测的结果显示，激发型CD28单抗参与诱导的CIK对MCF-7杀伤率为24.3%，高于对照组的9.68%。差异有统计学意义（P<0.05）。AnnexinV/PI的分析结果显示，激发型CD28单抗参与的CIK，其诱导MCF-7细胞的凋亡为13.7%及死亡为13.9%，而对照组的凋亡率和死亡率分别为10.1%和9.88%，两组差异有统计学意义（P<0.05）。结论：激发型CD28单抗可增强CIK对乳腺癌细胞株MCF-7的杀伤能力。该抗体可作为新型的CIK的诱导剂以提高诱导细胞的增殖与杀伤能力。