内含肽Npu DnaE是一种剪接活性和断裂活性较高的天然断裂内含肽。断裂内含肽的N端剪接区域（I_N）和C端剪接区域（I_C）片段具有特异性的识别与较强的结合能力,而且I_N和I_C片段在结合之前剪切活性不会被激活,因而不存在提前断裂的问题。因此,断裂内含肽显然是外源蛋白质表达与纯化的更优选择。本文通过分子生物学手段构建了具有不同结构的亲和配基片段N和融合蛋白表达片段CG。针对亲和层析过程中的不同条件,希望在不同结构片段的组合中找到与层析过程契合度最好的结构组合及断裂条件,并最终将其应用于对目标蛋白的纯化过程中。主要开展以下几方面的工作:1)Npu DnaE亲和纯化体系中亲和配基I_N片段与融合蛋白表达片段I_C-GFP的结构设计与改造。对内含肽Npu DnaE结构中的保守位点Cys1和Asp118进行突变提高其断裂反应的速率。设计时在I_N的C末端添加一个半胱氨酸Cys,利用Cys上的巯基将I_N连接到琼脂糖基质上。利用I_N和I_C-GFP两侧添加His标签的位置和氨基酸多少的不同,构建了结构不同的亲和配基片段与融合蛋白表达片段。构建重组菌进行表达纯化,最终成功获得了三种亲和配基片段N1、N2、N₃和两种融合蛋白表达片段CG1、CG2。2)非介质条件下N和CG片段的断裂活性比较。六种组合在DTT诱导下的断裂活性的实验结果表明,在I_N片段以及I_C片段的N端添加氨基酸序列可以改变I_N与I_C结合过程中的空间位阻从而改变断裂反应进行的速率。筛选出反应速率较快的四种组合N2&CG1、N2&CG2、N₃&CG1、N₃&CG2,其断裂完成时间分别为10 h、4 h、1 h、1 min。在Zn²⁺抑制实验中发现,Cys1是除His48,Asp118和+1Cys之外对Zn²⁺抑制起关键作用的氨基酸。只有将C1A突变进行恢复的四种断裂反应组合才具有Zn²⁺抑制效果。结合亲和纯化具体过程的要求,本文对首位氨基酸为Cys的四种断裂反应组合的断裂过程与亲和纯化过程的契合度进行比较,将E（N₃&CG1）和F（N2&CG2）确定为构建亲和纯化系统的可行方案。3)Npu DnaE亲和层析纯化体系的构建及其纯化效果研究。将亲和配基片段N₃与琼脂糖基质进行偶联,制备亲和层析介质N₃ Purose 6 Fast Flow,并构建了亲和纯化系统N₃ Purose 6 Fast Flow&CG1和N₃ Purose 6 Fast Flow&CG2。经过纯化两种系统均获得了单一的目标蛋白GFP条带。通过比较,N₃ Purose 6 Fast Flow&CG1系统的回收率较高（54.7%）但静置时间较长（30 min）,而N₃ Purose 6 Fast Flow&CG2系统的回收率较低（50.9%）但静置时间较短（2 min）。因此,认为本实验中构建的两种系统均为可行的内含肽介导的新型亲和纯化系统。