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研究目的:构建可表达TACO基因特异性si RNA的慢病毒干涉载体,在此基础上探讨TACO对巨噬细胞清除胞内结核分枝杆菌的影响及相关机制,为后续活体内靶向性抗Mtb感染的研究提供方向和基础。研究方法:1.根据TACO基因的m RNA序列选择3条靶序列,遵照si RNA设计原则设计相应的sh RNA,同时设计一条碱基序列被随机打乱的序列作为对照sh RNA序列。针对各sh RNA分别设计一对单链寡聚脱氧核苷酸,经退火形成相应sh RNA表达的双链DNA片段,再通过切分子克隆的方法将其插入sh RNA慢病毒表达框架质粒p Sico R,获取四个重组慢病毒表达载体p Sico R-TACO-si RNA。经酶切及测序鉴定无误后,将其分别命名为p SRT1-4,其中p SRT4为含对照sh RNA表达序列的慢病毒表达质粒。2.将重组慢病毒干涉载体(p SRT1-4)同膜蛋白质粒p MD2G与慢病毒包装质粒p SPAX2按一定比例混合包装病毒颗粒,收集可表达相应sh RNA的病毒颗粒(分别命名为LV-p SRT1-4)。收集的慢病毒颗粒采用超滤离心管浓缩法进行病毒颗粒的浓缩,再用逐孔倍比稀释法感染293T细胞,通过检测荧光表达细胞个数,进行病毒滴度计算。将包装后的慢病毒以一定比例感染RAW264.7细胞,48h后裂解细胞提取细胞总RNA进行荧光定量PCR检测巨噬细胞内TACO基因转录水平表达情况。再将经慢病毒感染72h的RAW264.7细胞裂解提取细胞总蛋白进行Western Blot蛋白印迹法,检测巨噬细胞内TACO蛋白的表达情况,筛选干扰效果最佳的重组慢病毒干涉载体。3.分别用LV-p SRT1和LV-p SRT4感染RAW264.7细胞,72h后采用Mtb H37Rv分别对这些细胞进行感染,于感染4h后洗去细胞外未被吞噬的细菌并以此时间点计为0h。细胞分别于Mtb感染后0h、24h、48h和72h采用1%triton进行裂解,释放出未杀灭的细菌,经稀释后均匀涂布于M7H10平板,待菌落生长后进行计数,并统计比较各组差异。4.采用Alexa Fluor®647染料对MTB H37Rv进行染色,用此染色后的MTB分别对未感染或经LV-p SRT1或LV-p SRT4感染后的RAW264.7细胞进行感染,24h后,采用免疫荧光法结合激光共聚焦显微镜观察各组细胞内Mtb与溶酶体的共定位情况,探讨下调TACO表达对MTB吞噬体与溶酶体融合率的影响。5.分别用LV-p SRT1和LV-p SRT4对巨噬细胞进行感染,72h后再用MTB H37Rv按MOI=5:1的比例对这些巨噬细胞进行感染,同时设置不用MTB感染的对照组。24h后,裂解各组细胞,采用western-blot法检测LC3的表达水平,评价下调TACO表达对巨噬细胞自噬水平的影响。研究结果:1.酶切和测序结果显示,TACO特异性si RNA慢病毒干涉载体PSRT1,PSRT2,PSRT3及对照序列慢病毒干涉载体PSRT4构建成功。2.将包装、浓缩后的慢病毒感染293T细胞24h后即可检测90%荧光,经病毒滴度检测其滴度均可达1~2×108 TU/m L以上,符合转染所需病毒滴度。慢病毒感染巨噬细胞48h后荧光表达率可高达90%。3.荧光定量PCR结果显示LV-p SRT1,LV-p SRT2,LV-p SRT3对RAW264.7细胞TACO m RNA的抑制率分别为85.24%,80.71%和42.49%,抑制效果最强的为PSRT1。Western Blot免疫印迹结果同荧光定量PCR结果一致,根据其灰度扫描,LV-p SRT1,LV-p SRT2,LV-p SRT3感染组RAW264.7细胞的TACO相对表达量分别为0.31,0.38,0.47。4.荷菌量的结果显示,LV-p SRT1可显著促进巨噬细胞对MTB的杀伤能力。与LV-p SRT4感染组比较,LV-p SRT1对巨噬细胞内MTB存活的相对抑制率在24h、48h和72h时分别为47.26%、53.00%、63.92%。5.与LV-p SRT4相比,LV-p SRT1感染可显著提高RAW264.7细胞内MTB与溶酶体的共定位率(75.67%vs Con组:9.33%),提示下调TACO的表达可显著增强MTB吞噬体与溶酶体的融合率。6.Western Blot检测结果显示,LV-p SRT1感染对RAW264.7细胞LC3的表达以及LC3Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值均无明显影响,提示下调TACO表达对巨噬细胞的自噬水平无明显影响。结论:1.本研究成功构建了靶向小鼠TACO基因的sh RNA的重组慢病毒载体,并通过慢病毒包装成功获取了可表达TACO基因特异性sh RNA的慢病毒颗粒。2.通过实时荧光定量PCR及Western blot检测方法,筛选出TACO-sh RNA1(PSRT1)为最有效的干扰序列,为进一步验证其抑菌功能奠定了基础。3.研究证实PSRT1可显著增强巨噬细胞杀伤胞内MTB的能力。4.研究发现抑制TACO的表达可有效促进巨噬细胞内含MTB的吞噬体与溶酶体的融合,提示TACO的存在可能是阻碍巨噬细胞内MTB吞噬体成熟的主要机制之一。5.研究显示抑制TACO的表达对巨噬细胞的自噬水平无明显影响,提示PSRT1促进MTB吞噬体与溶酶体融合的功能并不是通过自噬-溶酶体途径实现的,具体机制有待进一步的研究。