腰背痛是临床常见病及多发病,症状性腰背部疼痛的发病机制尚不完全明确,腰椎间盘退行性变(Intervertebral disc degeneration, IDD)被认为是腰背部疼痛的重要原因,椎间盘的退变过程包括髓核细胞数目、细胞外基质如糖蛋白、蛋白多糖等成分的减少,以及各种炎性因子表达的增加。目前研究发现局部炎性细胞因子刺激,是导致椎间盘源性腰腿痛的重要原因。而我们前期研究发现,辅助性T细胞17(Thelper cell 17,Th17)细胞在突出退变椎间盘组织中有较高表达,局部分泌炎性细胞因子白介素-17(Interlukin-17,IL-17)等并形成局部炎性环境,在退变椎间盘炎症反应中发挥重要作用。然而,IL-17如何发挥致炎作用、其作用机制以及涉及的信号通路,尚未完全明确。退变椎间盘细胞可表达大量炎症介质,包括IL-1,IL-6,肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α),前列腺素E2(Prostaglandin E2, PGE2),氮氧化物(NOX)等,其中PGE2与疼痛症状的关系最为密切,而环氧化酶-2(Cyclooxygenase 2,COX2)是PGE2合成的关键性限速酶。髓核细胞中,IL-17是否可以诱导COX2的表达及PGE2的产生,并通过二者发挥致炎作用,导致椎间盘内炎症反应,尚无明确研究。IL-17在椎间盘组织内作用的具体作用机制也不明确。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, APK)信号转导通路是已经被广泛研究的信号通路,其可参与细胞增殖、分化及凋亡等病理生理过程；转录因子活化蛋白-1(activator protein-1,AP-1)作为MAPK的下游因子,包括c-jun和c-fos蛋白家族,可通过促进炎症反应来参与多种疾病的病理生理过程。现有研究表明,MAPK信号通路及AP-1在椎间盘退行性变以及髓核细胞和软骨细胞的炎症过程中发挥重要作用。IL-17是否可以通过MAPK信号转导通路和转录因子AP-1参与椎间盘内炎症反应,使我们研究的一个重点。股骨头坏死(Osteonecrosis of femoral head, ONFH)是骨科常见疾病之一,患者主要变现为髋关节疼痛及活动障碍,随着病情进展,患者可出现股骨头塌陷,行走困难,往往需要手术治疗。股骨头坏死常见病因包括外伤、酗酒、大量糖皮质激素的应用等,然而其具体发病机制尚不明确,关于发病机制的相关假说有：血管损伤修复学说、脂质代谢紊乱学说等,但没有一种能作出合理的解释。目前对股骨头坏死的研究已经深入到分子、基因水平,发现坏死股骨头骨质中多种炎症分子表达增加,髋关节液中炎症因子及骨与软骨降解产物的含量也明显增加,这说明在股骨头坏死病理过程中,整个髋关节都发生病理改变并存在明显的炎症反应。对股骨头坏死的研究不应局限在股骨头本身,应该对髋关节整体进行相关研究。目前对股骨头坏死过程中炎症反应的研究仍较少,炎症因子及炎症反应在股骨头坏死病理过程中的作用仍不明确。在股骨头坏死患者的关节液中,软骨降解产物的水平明显增高,即使在股骨头坏死早期,也发现了软骨降解退变的相关证据,我们猜测软骨退变在股骨头坏死的发病过程中起到了一定作用,但软骨降解的原因及机制亦不明确。含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶-7(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs,ADAMTS-7)是新近发现的新型金属蛋白酶,在生长发育、血管生成、凝血、恶性肿瘤侵袭性、腰椎间盘突出症、风湿性关节炎、骨关节炎等病理生理过程中发挥重要作用。近期研究发现,ADAMTS-7可降解软骨细胞外基质软骨寡聚基质蛋白,并在骨关节炎的发生中起重要作用,同时,ADAMTS-7可被多种炎症因子诱导表达。ADAMTS-7是否也参与了股骨头坏死中软骨的降解,是否与髋关节中炎症环境有关,是我们本研究的另一个重点。本研究分为三部分：第一部分旨在研究IL-17A和COX2在椎间盘组织及髓核细胞中表达；第二部分旨在研究IL-17A对髓核细胞致炎作用的相关机制；第三部分为IL-17A在股骨头坏死软骨退变中的作用及机制研究第一部分：IL-17A和COX2在椎间盘组织及髓核细胞中表达的研究研究目的：检测椎间盘突出症患者椎间盘组织中Th17相关细胞因子IL-17A及疼痛相关因子COX2的表达,研究髓核细胞中IL-17A对COX2及其下游分子PGE2的作用。研究方法：选取2014年2月-2015年4月于山东大学齐鲁医院住院行手术治疗的腰椎问盘突出症患者56例为实验组,以及行手术治疗的脊柱外伤患者8例为对照组。取患者术中切除的部分腰椎间盘组织,通过免疫组织化学法检测2组患者椎间盘组织中的IL-17A和COX-2的表达。体外实验：选择11例腰椎间盘突出症患者髓核组织提取原代髓核细胞进行培养,取第三代髓核细胞加入IL-17A进行培养,设置IL-17A浓度梯度及时间梯度,收集细胞培养上清液,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测PGE2的浓度,收集髓核细胞,提取细胞总蛋白,通过蛋白质免疫印迹实验(Western Blot)检测髓核细胞中COX2的表达情况。研究结果：1.免疫组织化学结果显示实验组患者椎间盘组织中IL-17A及COX-2均有表达,表达水平较对照组明显提高,并存在统计学差异(P<0.01)。2.IL-17A刺激原代髓核细胞后,能够明显提高髓核细胞中COX-2和PGE2的表达,并存在明显的浓度依赖性和时间依赖性。研究结论：IL-17A能够诱导COX2和PGE2的表达。在多种疾病中,COX2和PGE2在炎症过程及疼痛中扮演重要角色,而COX2是PGE2合成的关键性限速酶,IL-17A可能通过诱导COX-2的表达,进一步导致PGE2生成,从而在退变腰椎间盘炎症反应及腰背部疼痛中发挥重要作用。第二部分：IL-17A对髓核细胞致炎作用相关机制的研究研究目的：研究IL-17A对髓核细胞中MAPK信号转导通路和转录因子AP-1的作用,探讨MAPK信号通路和转录因子AP-1在IL-17A诱导的COX2和PGE2表达中的调控机制。研究方法：使用体外培养的原代髓核细胞,加入浓度为10Ong/ml 和 IL-17A进行刺激,western blot检测不同时间内p38 MAPK、JNK MAPK、ERK1/2 MAPK的活化表达情况；用IL-17A分别刺激p38、JNK、ERK1/2信号通路抑制剂预处理髓核细胞,ELISA法检测细胞培养上清液中PGE2的浓度,提取髓核细胞总蛋白,western blot检测COX2的表达情况；用IL-17A刺激原代髓核细胞以及p38MAPK、JNK MAPK抑制剂处理后的髓核细胞,免疫荧光检测髓核细胞中磷酸化c-jun的表达情况,提取细胞核蛋白,western blot检测c-jun和c-fos的表达；用IL-17A刺激AP-1抑制剂预处理的髓核细胞,ELISA法检测细胞培养上清液中PGE2的浓度,Western blot检测COX-2的表达情况。研究结果：1.IL-17A可刺激髓核细胞激活p38 MAPK 和 JNK MAPK信号转导通路。在原代髓核细胞中,IL-17A能够迅速诱导P38 MAPK 和 JNK MAPK的磷酸化,随着时间延长,二者磷酸化水平逐渐降低,但是IL-17A刺激不能导致ERK1/2 MAPK的磷酸化。2. p38 MAPK 和 JNK MPAK抑制剂可显著抑制IL-17A诱导的COX2和PGE2的表达,、Vestern blot和ELISA结果分别显示,p38 MAPK 和 JNK MAPK抑制剂单一使用和联合使用,均能显著降低COX2和PGE2的表达,但是ERK1/2 MAPK抑制剂对COX2和PGE2的表达无明显影响。这说明,IL-17A通过激活p38MAPK和JNK MAPK信号通路而上调COX2和PGE2的表达,以发挥其致炎作用。我们还发现,p38 MAPK 和 JNK MAPK抑制剂二者单一使用时,均可导致COX2和PGE2的表达下降80%以上,一条通路被阻断的效果并不能够被另一条的激活所代偿,这说明P38 MAPK 和 JNK MAPK二者相互独立,IL-17A发挥作用需二者的同时激活,这可能与下游的转录因子活化有关。3.对MAPK信号通路下游转录因子AP-1进行研究,免疫荧光结果显示,未处理的髓核细胞中,c-jun磷酸化水平较低,IL-17A刺激后,髓核细胞中c-jun的磷酸化水平明显增高,而JNK抑制剂可阻断IL-17A诱导的c-jun磷酸化；western blot结果表明,IL-17A能够显著激活c-jun和c-fos二者在细胞核内的表达,加入MAPK抑制剂后,p38 MAPK抑制剂可抑制c-fos的细胞核内表达,但对c-jun无明显影响,而JNK MAP K的抑制剂可以抑制c-jun的核内表达,但对c-fos无影响。4.AP-1抑制剂可阻断IL-17A上调COX2和PGE2表达的作用,这说明IL-17A对髓核细胞的作用,有赖于转录因子AP-1的活化。研究结论：1.IL-17A可以激活P38 MAPK 和 JNK MAPK信号转导通路；2.IL-17A诱导COX2和PGE2的表达有赖于P38 MAPK 和 JNK MAPK信号通路的激活,并且,p38 MAPK 和 JNK MAPK信号通路需同时激活,IL-17A方可发挥其致炎作用。3.IL-17A可以诱导髓核细胞内c-jun的磷酸化,并上调c-fos和c-jun在髓核细胞内的表达,这证明了IL-17A可以激活髓核细胞中转录因子AP-1的表达。4.在髓核细胞中,转录因子AP-1参与了IL-17A上调COX2蛋白的表达及其下游产物PGE2的表达过程。5.IL-17A在髓核细胞内可通过诱导P38 MAPK磷酸化,上调c-fos在细胞核内的表达,通过诱导JNK MAPK的磷酸化,而上调c-jun磷酸化和表达,c-fos和c-jun组成c-fos/c-jun异源二聚体而形成活化的转录因子AP-1,从而激活COX2的转录表达,进而促进PGE2的产生,从而诱导髓核细胞炎症反应。6.IL-17A通过p38/c-fos和JNK/c-jun途径激活转录因子AP-1,从而上调COX2的表达和PGE2的生成,从而在椎间盘组织中发挥致炎作用。第三部分：IL-17A在股骨头坏死软骨退变中的作用及机制研究研究目的：研究股骨头坏死髋关节液中炎症介质IL-17A的表达,及坏死股骨头软骨组织中ADAMTS-7的表达与软骨退变情况的关系,并探讨IL-17A对ADAMTS-7表达的影响及可能作用机制。研究方法：选取于山东大学齐鲁医院住院行手术治疗的股骨头坏死患者34例为实验组,及股骨颈骨折患者14例为对照组。使用ELISA法检测股骨头坏死患者关节液中IL-17A的表达情况；HE染色和番红固绿染色评价软骨退变情况；免疫组织化学染色研究ADAMTS-7 和 p-NFκB p65的表达水平；提取原代软骨细胞,加入IL-17A刺激后,检测软骨细胞中ADAMTS-7的表达水平及NFκBp65的活化水平。研究结果：1.股骨头坏死髋关节液ELISA结果显示,股骨头坏死关节液中IL-17A含量明显增加。2.软骨HE染色和番红-固绿染色结果显示()NFH患者股骨头软骨随病情进展逐渐发生退行性改变。3.免疫组织化学、Western Blot和RT-PCR结果显示,ONFH股骨头软骨中ADAMTS-7的转录表达均明显增加,同时,、Western Blot结果显示随着股骨头坏死患者软骨组织中COMP降解增加.4.免疫组织化学显示ONFH患者软骨组织中磷酸化NF-κB P65表达增加,IL-17A可诱导软骨原代细胞中ADAMTS-7的表达,同时激活NF-κB P65。研究结论：1.股骨头坏死患者髋关节液中IL-17A含量增加；2.坏死股骨头软骨组织中ADAMTS-7表达增加,并可能通过降解软骨基质中COMP导致软骨退变；3.IL-17A可能通过激活NF-κB信号转导通路诱导软骨细胞表达ADAMTS-7。