霉菌毒素是一类存在于饲料原料和配合饲料中的抗营养因子,它们是由不同类属的真菌产生的二级有毒代谢物,在我国霉菌不仅污染动物饲料,而且还给畜牧业经济造成严重损失,其中赭曲霉菌是霉菌中最重要的一类。赭曲霉毒素(OT)是由两种主要类型的青霉菌及曲霉菌共同产生,共有A、B、C等7种类型,其中赭曲霉菌A(Ochratoxin,OTA)分布最广,毒性最强,具有肾毒、肝毒、致畸、致癌、致突变和免疫抑制作用。OTA被认为是引起人类和动物疾病,以及食品加工过程中造成污染的一个重要指标。由于该毒素其对热及其不敏感,很难通过热处理去除,一旦误食极易在机体蓄积并以其慢性中毒严重的甚至会引发癌症。对人类健康及动物生产造成极大的威胁。目前,关于OTA致小鼠亚急性肾脏损伤的机制尚不完全明确。虾青素(astaxanthin,ASX)是一种类胡萝卜素,因其拥有9个连续ππ共轭双键的独特化学结构所产生的巨大化学多样性而被持续广泛关注。这些生物活性化合物具有抗氧化、修复细胞、抗增殖、抗发炎、抗衰老作用。最新的研究发现,虾青素对动脉粥样硬化、阿尔海默氏症、帕金森、肝硬化、糖尿病、肺纤维化都有显著的临床治疗作用。然而,对OTA诱导的小鼠亚急性肾损伤的保护效果及其分子机制尚不明确。本研究以6周龄C57BL/J小鼠为实验动物,共计80只,随机分为四组(每组n=20):I组(对照组),II组(OTA),III组(ASX)和IV组(ASX+OTA)。。I组接受0.1 ml橄榄油,然后在2小时后用0.1 ml Na HCO3灌胃。II组接受5mg/kg/天的OTA,然后2小时后接受0.1毫升橄榄油灌胃。第三组接受ASX的剂量为100 mg/kg/天,然后在2小时后接受0.1 ml Na HCO3灌胃。第IV组接受100 mg/kg/天的ASX,2小时后他们接受5 mg/kg BW/天的OTA灌胃。每周进行7天的治疗,然后中断2天,重复3次。试验采用Tunel染色、投射电镜、Western Blot、Real Time-PCR等先进分子生物学技术,探讨OTA亚急性暴露对小鼠肾脏细胞凋亡、增殖、炎症、氧化相关基因表达的影响以及Nrf2/keap1信号通路在此期间所扮演的角色,探明ASX能否通过影响凋亡、炎症、增殖、氧化相关基因干预OTA致小鼠亚急性肾损伤及其干预效果的可能性。小鼠饲料消耗量、平均体重及脏器系数结果表明:OTA暴露及ASX干预27天后,与对照组相比,OTA组的饲料消耗量、平均体重和肾器官系数显著降低(p<0.01)。ASX处理后,小鼠的饲料消耗量和平均体重均显著增加(p<0.01),但肾器官系数与对照组相比无显著性差异。与OTA组相比,ASX组和OTA组小鼠的饲料消耗量和平均体重均显著增加(p<0.01),而肾器官系数无显著性差异。各组小鼠血清生化指标结果表明:OTA暴露及ASX干预27天后,与对照组相比,OTA组小鼠血清UA和BUN水平显著升高(p<0.01和p<0.05),而CRE水平无明显影响。与对照组相比,ASX对血清UA、BUN、CRE水平无明显影响。此外,ASX组的UA和BUN水平。小鼠形态学及超微结构结果表明:OTA暴露及ASX干预27天后,对照组肾小球结构完整,肾小囊腔大小均匀,近端小管上皮细胞排列紧密,管腔直径大,管腔不规则,胞体大。OTA暴露后,肾小管肿胀,管腔变窄甚至消失,官腔上皮细胞可见明显的颗粒变性、水泡变性、细胞核核浓缩甚至核溶解。ASX对照组未发现明显的形态学改变。OTA+ASX组肾小球肿胀及肾小管上皮细胞变性坏死现象得到明显的改善。投射电镜下,肾细胞、线粒体结构清晰、完整。线粒体嵴排列整齐,细胞核染色质分布均一。相比之下,OTA治疗组线粒体结构混乱且嵴消失,,核染色质分散,基底膜增厚,核膜消失,内质网肿胀。ASX+OTA组肾小管结构的破坏及肾小球肿胀情况明显得到改善,几乎恢复到正常结构OTA暴露后对小鼠肾脏细胞凋亡及ASX干预效果结果表明:(TUNEL)染色结果显示,与对照组相比,OTA处理后凋亡细胞明显增多(p<0.01)。ASX组与ASX+OTA组比较无显著性差异。ASX组和ASX+OTA组凋亡细胞数明显低于OTA组(p<0.01)。与凋亡基因相关基因检测结果显示,与对照组比较,OTA组P53、Caspase-3、Bax、Bcl-2 m RNA表达量显著增加(p<0.01)。ASX干预27天后,与OTA组相比bcl-2m RNA表达剂量显著增加(p<0.01)。其他各项指标均呈显著降低(p<0.01)。ASX组较对照组比较Bcl-2 m RNA表达量显著增加(p<0.01)。说明抑制凋亡基因、并促进凋亡基因的表达可能是ASX干预OTA亚急性暴露诱导的小鼠肾脏细胞凋亡的重要分子机制。炎症和增殖相关基因表达结果显示:OTA暴露及ASX干预27天后,与对照组比较,OTA组肾脏TNF-αm RNA表达及细胞质NF-?B蛋白表达显著减少(p p<0.05或p<0.01),细胞核NF-?B蛋白、TGF-β、IL-1β、IL-6、NF-?Bm RNA表达增加(p<0.01)。ASX干预27天后,与OTA组相比,ASX+OTA组TNF-α、TGF-βm RNA及细胞质NF-?B蛋白表达增加(p<0.05或p<0.01),细胞核NF-?B蛋白、IL-1β、IL-6、NF-?B m RNA表达量减少(p<0.05或p<0.01)。ASX组与对照组相比,TNF-α、TGF-βm RNA表达量升高(p<0.01)NF-?B m RNA表达水平显著降低(p<0.05)。其他各项指标均无同统计学差异。说明ASX可能通过促进细胞增殖基因表达,通过抑制促炎基因表达,进而干预OTA亚急性暴露诱导的肾脏炎症核细胞增殖能力。氧化相关标志物及基因蛋白表达结果显示:OTA暴露及ASX干预27天后,氧化相关指标结果显示:与对照组相比,OTA染毒后肾脏组织中MDA含量显著增加((p<0.01),GSH、T-SOD、CAT含量水平显著下降((p<0.01)。ASX预干预27天后,与OTA组比较,小鼠肾脏组织内MDA含量显著下降(p<0.01),GSH、T-SOD、CAT含量水平显著升高((p<0.01)。对照组与ASX组比较,CAT含量显著升高((p<0.01),其他各项指标均无统计学差异。Nrf2-Keap1信号通路相关基因表达结果表明,与对照组相比,OTA治疗组Nrf2、Nqo1、Ho1、Gclc、Gpx1 m RNA水平表达显著降低(P<0.05或P<0.01)。Keap1 m RNA水平显著升高(p<0.01)。相比之下,ASX治疗组Nrf2、Nqo1、Ho1、Gclc和Gpx1的m RNA水平显著高于对照组(p<0.05或p<0.01),Keap1的m RNA水平显著低于对照组(p<0.05)。ASX+OTA治疗组Nrf2、Nqo1、Ho1、Gclc和Gpx1的m RNA水平显著高于OTA组(p<0.05或p<0.01),Keap1的m RNA水平显著低于OTA组(p<0.01)。Nrf2-Keap1信号通路相关蛋白表达结果表明,OTA治疗后NRF2相关靶蛋白NQO1、HO-1、γ-GCS、GSH-Px水平较对照组下降(p<0.05或p<0.01),而KEAP1水平升高(p<0.01)。ASX治疗后,ASX组和ASX+OTA组NRF2相关靶蛋白水平较OTA组升高(p<0.05或p<0.01),KEAP1水平下降(p<0.05),核内NRF2蛋白水平显著升高,细胞质中NRF2水平显著下调(p<0.05或p<0.01)。本研究结果表明,ASX可以促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、坏死、炎症,提高机体抗氧化能力来保护OTA诱导的肾损伤,并揭示ASX通过Nrf2-Keap1信号途径实现OTA诱导肾脏损伤保护作用的重要机制。