目的PLD4是一种新蛋白,属于PLD家族中的一员。PLD4由于缺乏PX和PH域,所以并没有PLD酶活性。动物实验研究表明虽然PLD4在体内广泛表达,但在免疫密切相关的组织中,肝脏、脾脏、脑组织、淋巴结的PLD4表达水平相对较高。研究发现小鼠大脑皮质的原始小胶质细胞存在PLD4表达,LPS刺激后小胶质细胞中PLD4表达显著提高,并发现PLD4可促进小胶质细胞活化。肿瘤相关巨噬细胞在识别和杀伤结肠癌过程中具有重要作用。虽然小胶质细胞和肿瘤相关巨噬细胞具有免疫学共性,但PLD4在肿瘤相关巨噬细胞中的表达及具体功能尚未有相关研究。故本研究拟探讨PLD4在结肠癌肿瘤相关巨噬细胞中的表达及功能。方法(1)结肠癌组织中检测PLD4表达采用免疫组织化学方法检测110例结肠癌患者组织标本中PLD4表达情况。并在同一组织连续石蜡切片中,采用CD68标记结肠癌组织中肿瘤相关巨噬细胞,并研究PLD4阳性表达与CD68阳性巨噬细胞间联系。采用Western blot检测12例结肠癌患者癌组织及癌旁组织中PLD4蛋白表达水平。(2)THP-1肿瘤相关巨噬细胞模型的建立采用THP-1细胞作为巨噬细胞模型,首先THP-1细胞加入PMA诱导成为巨噬细胞,随后加入LPS联合IFN-γ诱导成为M1型肿瘤相关巨噬细胞,加入IL-4诱导成为M2型肿瘤相关巨噬细胞。采用分子表面标志CD86及CD16鉴定M1型肿瘤相关巨噬细胞;采用ELISA检测在巨噬细胞,M1型巨噬细胞及M2型巨噬细胞中促炎症因子IL-1,IL-8,IL-6及TNF-α表达水平。(3)THP-1巨噬细胞中存在PLD4表达采用Western blot检测THP-1巨噬细胞模型中PLD4蛋白表达水平。采用RT-PCR检测THP-1巨噬细胞模型中PLD4分子表达水平。(4)PLD4在M1型肿瘤相关巨噬细胞中的功能研究采用si RNA干扰PLD4在巨噬细胞中的表达,Western blot检测si RNA干扰后M1型巨噬细胞模型中PLD4蛋白抑制水平。QRT-PCR检测si RNA干扰后M1型巨噬细胞模型中PLD4分子抑制水平。采用ELISA检测在si RNA干扰后M1型巨噬细胞促炎症因子IL-1,IL-6及TNF-α表达水平,以研究巨噬细胞活化功能。(5)PLD4干扰后的M1型巨噬细胞条件培养基对结肠癌细胞影响分别收集PLD4干扰组与对照组条件培养基与HT-29、HCT116、SW620结肠癌细胞共培养,采用CCK8细胞增殖试剂盒,细胞凋亡试剂盒及细胞周期试剂盒检测条件培养基对三种结肠癌细胞株的细胞增殖、细胞凋亡与细胞周期的影响。结果(1)PLD4在结肠癌肿瘤相关巨噬细胞表达免疫组化发现PLD4呈环状表达于结肠癌组织的间质细胞及淋巴结细胞胞质中。在同一组织连续切片中发现部分CD68标记的肿瘤相关巨噬细胞存在PLD4阳性表达。分析110例结肠癌石蜡组织切片发现PLD4的阳性表达与结肠癌临床分期相关(P<0.01),与性别、年龄、病理分期及转移不相关。在12例结肠癌手术标本中,Western blot结果提示虽然结肠癌及癌旁组织中均存在PLD4表达,但PLD4在肿瘤组织中表达水平高于癌旁。(2)PLD4存在于M1型肿瘤相关巨噬细胞THP-1细胞作为细胞模型诱导成为巨噬细胞、M1巨噬细胞、M2巨噬细胞。流式细胞仪检测发现M1巨噬细胞高表达MHC-Ⅱ类分子CD16及CD86。同时EILISA结果表明M1巨噬细胞相对于M2及巨噬细胞表达更高水平IL-1,IL-8,IL-6及TNF-α等促炎因子。Western blot蛋白水平及RT-PCR分子水平分别发现PLD4表达于M1肿瘤相关巨噬细胞;(3)PLD4参与M1型肿瘤相关巨噬细胞的活化si RNA干扰巨噬细胞中PLD4表达后,Western blot及QRT-PCR结果发现si RNA干扰后M1型巨噬细胞模型中PLD4表达明显受到抑制。同时检测si RNA干扰后检测M1型巨噬细胞促炎症因子IL-1,IL-6及TNF-α表达,结果发现以上促炎因子水平明显降低。(4)PLD4介导M1型巨噬细胞发挥抑制结肠癌细胞增殖作用采用干扰PLD4表达组及对照组M1型巨噬细胞条件培养基分别培养HT-29、HCT116、SW620细胞,结果发现当PLD4被抑制时M1型巨噬细胞无法正常活化,导致M1巨噬细胞对结肠癌细胞杀伤作用减弱。结论(1)本研究证实结肠癌组织肿瘤相关巨噬细胞存在PLD4表达;(2)PLD4参与体外M1型肿瘤相关巨噬细胞正常活化;(3)PLD4通过介导M1型肿瘤相关巨噬细胞活化在体外发挥抑制结肠癌细胞作用。