论文部分内容阅读
近年来，苹果再植病害成为我国苹果主栽区品种更替及果园重建的主要制约因素，我们在前期调查中发现，镰刀菌是引起河北省苹果再植病害的主要病原菌，层出镰刀菌是其中一种重要致病菌。目前国内外对层出镰刀菌在苹果再植病害上的报道很少。而层出镰刀菌在苹果再植病害中的致病机制尚未见报道。为了解层出镰刀菌的致病机理，从基因层面揭示病原菌生长发育及致病相关基因，探索病害防治的新靶标，本研究以层出镰刀菌H10菌株作为T-DNA插入突变的原始菌株，利用前期优化的体系建立了T-DNA插入突变体库，并对获得的部分突变体的生长速率、产孢能力、致病力及插入拷贝数及插入侧翼序列进行了初步分析。主要结果如下: 1.借助实验室前期优化的农杆菌介导的转化体系，分别利用农杆菌AGL-1和含有绿色荧光蛋白标记的农杆菌LBA4404构建了插入突变体库，农杆菌AGL-1介导的转化共获得766个突变体，经PCR鉴定有386个转化子含有800bp左右的目的条带，阳性率为49.61％;农杆菌LBA4404介导转化共获得2620个转化子，随机挑选107个转化子经PCR鉴定，100个转化子均能够扩增出含有1000bp左右的目的条带，阳性率为93.45％。 2.经潮霉素B鉴定，连续转接5代转化子的颜色和菌落形态没有改变;用荧光显微镜对含有绿色荧光蛋白的转化子进行观察能发现绿色荧光。表明外源基因已经插入到H10基因组中并且能够稳定遗传。 3.对利用两种农杆菌获得的转化子，各选取100个进行形态学、生长速度、产孢能力和致病力分析。与野生菌株相比，农杆菌AGL-1介导的转化子中3％的转化子生长速率减慢，10％的转化子产孢量下降，转化子的致病力均有不同程度的减弱，未发现致病力完全丧失的转化子。 4.从完成了产孢量和致病力测定的转化子中，选取10个进行了Southern杂交分析，结果显示9个为单拷贝插入。 5.使用8个通用引物，利用TAIL-PCR对产孢量和致病力下降并且为单拷贝插入的转化子H10-989进行了侧翼序列扩增。结果表明，AD3引物的扩增效果较好，在第三轮扩增出单一的条带。将扩增到的片段进行回收测序，获得198bp的侧翼序列，将获得的序列经过NCBI-BLAST分析比对与水稻恶苗病菌58289基因草图1号染色体部分序列为同源序列。经blastx注释与尖孢镰刀菌5176菌株的假定蛋白同源性高。