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[目的]黄芪为著名的常用中药。山西浑源为黄芪传统道地产区,采用仿野生栽培,生长年限长,品质优良。“枯皮”和“空心”结构是高年限道地药材黄芪有别于速生芪的重要性状特征。为揭示“枯皮”和“空心”结构的形成及其对主要次生代谢产物分布的影响,尚需要阐明以下3个问题:(1)蒙古黄芪根中“枯皮”的发育是否为细胞程序性死亡(PCD)事件;(2)蒙古黄芪根中“空心”的发育是否为细胞程序性死亡(PCD)事件;(3)蒙古黄芪根中次生结构不同组织中次生代谢产物的分布及“枯皮”和“空心”结构的形成对根的不同组织中次生代谢产物的分布有无影响。阐述上述问题,有助于揭示黄芪道地药材“辨状论质”的科学内涵。[方法]本文运用石蜡切片、半薄切片、超薄切片,结合光学显微镜以及透射电子显微镜技术观察蒙古黄芪根中“枯皮”和“空心”的发育及形成过程中超微结构特征;利用DAPI染色与TUENL原位末端标记技术,在荧光显微镜下观察细胞DNA片段化,结合DNA提取及琼脂糖凝胶电泳法,以判定“枯皮”与“空心”结构的细胞程序性死亡(PCD)。在组织学观察的基础上,利用冰冻切片、激光显微切割与UPLC-Q/TOF-MS联用技术,探明蒙古黄芪根中次生结构和“枯皮”及“空心”的形成对根的不同组织中次生代谢产物分布的影响。[结果](1)蒙古黄芪根中“枯皮”的发生:“枯皮”的发育起源于次生韧皮部靠近周皮处的薄壁细胞恢复分生能力,产生新的周皮,随后发育成落皮层,是动态变化的过程。根据发育特点,将“枯皮”的发育过程分为最初期,落皮层形成早期,落皮层形成期及落皮层成熟期四个阶段。落皮层在发育过程中表现出PCD特征,如线粒体和内质网的降解,液泡融合,液泡膜破裂,液泡中存在被吞噬的细胞器和絮状结构,细胞质降解,细胞核畸形,核仁降解。DAPI染色及TUNEL检测结果表明,在落皮层形成前期及落皮层形成期,细胞核呈TUNEL阳性,成熟时DAPI和TUNEL均为阴性。DNA结果显示DNA降解呈拖尾状。“枯皮”的发生为植物生长过程中的PCD事件。(2)蒙古黄芪根中“空心”的发生:高年限蒙古黄芪根的次生木质部中产生了木栓环结构,形成木间木栓。宏观性状观察:蒙古黄芪根的横切面表面有黑点出现,纵剖发现黑点逐渐扩大,根中的枯朽部位往根头处伸展。石蜡和半薄切片结果显示,黑点的产生是由于导管被某种物质填充。“空心”起源于导管周围恢复分生能力的薄壁细胞。随后,木栓形成层径向分裂,形成木栓形成层,木栓形成层向内分化成木栓层,产生环状结构,即木间木栓。木间木栓的发育也是一个PCD事件。超微结构特征表现为细胞壁边缘有囊泡的产生,线粒体及高尔基体降解,膜系统紊乱,细胞质致密及细胞核畸形,细胞壁呈现不同程度的膨胀。细胞核的降解通常发生在木间木栓形成早期和木间木栓形成期,细胞核呈TUNEL阳性;而在木间木栓成熟期,DAPI染色和TUNEL检测均呈阴性。凝胶电泳显示DNA呈弥散状。(3)蒙古黄芪根的次生结构中不同组织的次生代谢产物研究结果显示:周皮共检测出15种化合物,皂苷类化合物有9种,黄酮类化合物4种;次生韧皮部测得17个化合物,11个黄酮类化合物,皂苷类化合物仅有3个;次生木质部共有18个化合物被识别,其中黄酮类化合物12个,皂苷类化合物3个。可见周皮较次生韧皮部及次生木质部的皂苷类化合物更为丰富,黄酮类化合物在次生韧皮部及次生木质部分布丰富且均匀,推测黄酮类化合物主要存在在薄壁细胞内。蒙古黄芪根中“枯皮”和“空心”结构的不同组织研究结果显示,“枯皮”共识别出25个化合物,其中黄酮类化合物6种,皂苷类化合物15种;“空心”结构共检测出28个化合物,包括黄酮类化合物10种,皂苷类化合物15种。“枯皮”中新产生的周皮或“空心”中木间木栓环出现的部位,皂苷类化合物分布明显增加,分别为13和15个,较其他的组织丰富;黄酮类化合物在死亡的细胞中并未表现出明显的减少。[结论](1)蒙古黄芪根中“枯皮”是落皮层结构,“空心”是根中次生木质部产生了异常结构,即木间木栓。两者的发生发育均为细胞程序性死亡(PCD)事件,表现为细胞核畸形,核仁消失及细胞内各种细胞器的降解,DNA片段化等典型的植物PCD特征。(2)黄芪根中“枯皮”和“空心”的形成导致了皂苷类成分的增多,黄酮类成分种类的增加,即黄芪“枯皮”和“空心”的出现影响了根中皂苷类与黄酮类成分的配比。