目的：骨缺损是骨科临床治疗巾所而临的难题之一。目前骨移植技术是治疗骨缺损及促进骨修复的重要方法。常用的骨移植技术有自体骨移植存在增加创伤、供量有限的缺点，而同种异体骨移植存在有免疫原性、生物相容性差等缺点。人工骨移植近三十年来是研究的热点，它具有来源广泛，可塑性强，安全方便的特点，并且具有良好的骨传导性。但是人工骨替代材料不具有生物活性，因此需要在体内外引入生物活性成分即细胞和细胞因子。在骨组织工程技术中的三个要素是：具有骨生成作用的成骨分化潜能的干细胞，具有骨传导作用的支架载体以及具有骨诱导作用的细胞因子。本研究从提高骨髓间充质干细胞成骨分化和改进支架材料两方面进行研究，以期为提高组织工程骨成骨分化能力提供有价值的信息。骨髓基质干细胞(BMSCs)是目前研究最多的种子细胞，骨髓组织中存在的间充质干细胞具有成脂、成肌、成软骨、成骨等多向分化潜能。目前，BMSCs已经成为骨组织工程中应用最为广泛的种子细胞，但是BMSCs在无诱导因子的作用下向成骨分化的比例非常低，而且在临床应用中通过骨髓穿刺获得的BMSCs数量很少，因此往往需要进行体外扩增培养才能达到所需的数量，在体外扩增后BMSCs可能进一步导致的分化潜能下降，为此，促进BMSCs成骨分化问题亟待解决。低氧环境对多种类型细胞的分化和基因表达产生影响，而骨折后血肿区域由于供血不足会在区域内造成低氧，并促进释放大量细胞因子。这种低氧环境对骨折区域骨再生可能存在影响，但低氧环境对骨髓问质干细胞向成骨细胞分化的影响目前没有一个确切的定论。对于骨组织工程的支架材料人们提出了诸多要求。为避免机体不良反应的发生，要求它们具有良好的生物相容性：由于骨组织工程支架材料要引导细胞生长，细胞基质形成和组织再生，并控制再生组织的结构、形态和尺寸，这就要求多孔支架具有优良的三维空间结构、力学性能和降解速率等。常用的骨支架有人工合成高分子材料和天然高分子材料。人工合成高分子材料具有可标准化生产、可降解及相容性好，并且在机械性能方面也强于天然材料等优点。但仍存在诸多缺点，如：材料降解后往往在局部形成酸性环境，缺乏细胞识别信号等；天然高分子材料，如胶原和壳聚糖等，生物相容性好，具有细胞识别信号，利于细胞粘附、增殖和分化，但机械性能稍差限制了其在骨组织工程领域内进一步的应用。前期研究证实以天然玉米醇溶蛋白为基础可制备出较好生物相容性、较高力学性特性的三维支架材料。为进一步提高该种支架材料的成骨诱导特性，我们尝试为其添加羟基磷灰石涂层并观察其成骨活性和力学特性的改变。 方法：为促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，我们利用去铁胺作为一种低氧模拟药物。去铁胺又名去铁敏，被作为一种低氧模拟药物用于科学研究，临床用于治疗高铝血症。利用骨形态发生蛋白-2(BMP-2)诱导BMSCs和多能C3H10T1/2细胞向成骨细胞分化；碱性磷酸酶染色用于检测成骨分化；茜素红染色用于晚期成骨细胞钙结节检测；RT-PCR和Western Blot分别用于检测基因和蛋白水平的变化。对于蛋白支架材料，首先通过沥盐法构建Zein三维支架材料，在此基础上，将此支架材料置于模拟体液内为其添加羟基磷灰石涂层。然后用扫捕电镜、比重法等对材料孔隙率孔隙大小做出评估，同时进行力学测试。RT-PCR、碱性磷酸酶染色、MTT等方法对材料的体外生物学相容性做出相应评估。 结果：对于骨髓间充质干细胞成骨分化，碱性磷酸酶定量结果显示在适当浓度的去铁胺(约15μM)作用下，BMSCs和C3H10T1/2细胞的碱性磷酸酶活性上升，但浓度超过30μM的去铁胺反而抑制其碱性磷酸酶活性;RT-PCR结果也显示适当浓度的去铁胺可以促进碱性磷酸酶、骨钙素、结缔组织生长因子和x型胶原的基因表达。Western Blots结果显示在成骨诱导分化过程中，适当浓度去铁胺作用下GSK-3β的磷酸化水平上升，说明其其活性受到抑制，导致GSK-3β的直接底物β-catenin的蛋白水平上升。利用RNA干扰技术下调β-catenin后发现去铁胺对碱性磷酸酶活性的促进作用消失。我们进一步研究发现去铁胺可以上调低氧诱导因子1(HIF-1α)蛋白并促进Akt的磷酸化。蛋白支架材料Zein添加羟基磷灰石涂层后孔隙率和孔隙大小没有明显区别，电镜、冷色谱分析证实材料表面形成羟基磷灰石涂层；但是添加羟基磷灰石涂层后材料的力学特性有所降低；在分子生物学方而，细胞贴附实验证明细胞于两种材料表面贴附速度没有明显区别；碱性磷酸酶活性分析和RT-PCR结果说明添加羟基磷灰石涂层可以促进人骨髓间充质干细胞于其表面向成骨细胞的分化。 结论：本研究中我们发现适当浓度的去铁胺可以促进多能干细胞向成骨细胞分化，该研究结果国际上尚未见报道。深入研究发现去铁胺促进干细胞向成骨分化是通过促进Wnt信号通路的激酶GSK-3β的磷酸化而抑制GSK-3β酶活性，从而引起Wnt信号通路得主要效应蛋白β-catenin的蛋白水平上升。β-catenin蛋白在该过程中起到重要作用。进一步研究证实，DFO可以通过HIF-1α途径上调Akt蛋白磷酸化水平，激活其激酶活性。激活的Akt激酶能导致GSK-3β的磷酸化水平上调。综上所述去铁胺在骨髓间充质细胞的分化中起到重要的作用，其机制可能是通过影响HIF-1α通路激活Wnt信号通路并上调β-catenin蛋白，最终影响干细胞分化。将蛋白支架材料与无机物复合制成复合支架材料在国际上尚未见报道。为玉米醇溶蛋白支架材料添加羟基磷灰石涂层后，我们发现BMSCs可以于HA-Zein材料表面贴附并很好的伸展。尽管BMSCs于HA-Zein材料表面的增殖能力有所下降，但是添加羟基磷灰石涂层后，与对照组Zein相比HA-Zein拥有更高的碱磷酶活性和成骨标志基因表达水平。而且HA-Zein支架材料的力学特性基本上符合骨纽织工程的力学要求，我们认为多孔支架材料Zein添加羟基磷灰石涂层后获得更高的成骨分化潜能，并有可能应用于骨组织工程。