目的:　　 为了研究人巨细胞病毒(HCMV)编码的白细胞介素-10剪接体(cytomegalovirusinterleukin-10,cmvIL-10和latency associated cmvIL-10,LA-cmvIL-10)在HCMV潜伏及再激活感染中的作用,构建了cmvIL-10和LA-cmvIL-10基因的原核表达体系,并制备了其特异性抗血清。本研究将为更深入的研究cmvIL-10和LA-cmvIL-10的功能及在HCMV感染中的作用奠定基础,进而为阐明HCMV潜伏感染及再激活的机制提供新的思路。　　 方法:　　 1、HCMV基因组DNA提取、cmvIL-10基因的PCR扩增、克隆载体的构建及序列测定　　 收集HCMV感染患儿尿液标本提取病毒基因组DNA,利用重叠延伸PCR的方法,以提取的病毒DNA为模板,扩增cmvIL-10完整的基因,将其克隆入pMD18-Tsimple vector中构建重组了pMD18-T-cmvIL-10,并用限制性内切酶酶切和测序鉴定重组子。　　 2、LA-cmvIL-10基因PCR扩增、克隆载体的构建及序列测定　　 以重组子pMD18-T-cmvIL-10为模板,扩增LA-cmvIL-10基因,将其克隆入pMD18-T simple vector中构建重组子pMD18-T-LA-cmvIL-10,并用限制性内切酶酶切和测序鉴定重组子。　　 3、原核重组子pMa1-c2x-cmvIL-10和pMa1-c2x-LA-cmvIL-10表达载体的构建及鉴定　　 分别以EcoRⅠ/HindⅢ双酶切pMD18-T-cmvIL-10和pMD18-T-LA-cmvIL-10,将528 bp和420 bp的酶切片段克隆至pMal-c2x的EcoRⅠ/HindⅢ位点,转化感受态受体菌E.coli DH5α,并酶切鉴定。　　 4、cmvIL-10和LA-cmvIL-10重组蛋白的诱导表达及纯化　　 将重组表达质粒pMal-c2x-cmvIL-10和pMal-c2x-LA-cmvIL-10转化到感受态受体菌E coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达目的蛋白,目的蛋白利用Amylose-resin亲和层析柱进行纯化,并经SDS-PAGE电泳分析。　　 5、cmvIL-10和LA-cmvIL-10抗血清的制备及鉴定　　 将纯化后的pMa1-c2x-cmvIL-10和pMa1-c2x-LA-cmvIL-10表达蛋白免疫家兔制备多克隆抗血清,并用Western blot鉴定。　　 结果:　　 1、HCMV基因组DNA提取、cmvIL-10基因的PCR扩增、克隆载体的构建及序列测定　　 应用重叠延伸PCR扩增出528bp的cmvIL-10基因片段,重组子pMD18-T-cmvIL-10经EcoRⅠ/HindⅢ双酶切鉴定及测序分析,结果显示与HCMVAD169株cmvIL-10序列一致。　　 2、LA-cmvIL-10基因PCR扩增、克隆载体的构建及序列测定　　 以pMD18-T-cmvIL-10质粒为模板经PCR扩增出420 bp的LA-cmvIL-10基因片段,重组子pMD18-T-LA-cmvIL-10经EcoRⅠ/HindⅢ双酶切鉴定及测序分析,结果显示与HCMV AD169株LA-cmvIL-10序列一致。　　 3、原核重组子pMa1-c2x-cmvIL-10和pMa1-c2x-LA-cmvIL-10表达载体的构建及鉴定　　 原核重组子pMa1-c2x-cmvIL-10和pMa1-c2x-LA-cmvIL-10分别经EcoRⅠ/HindⅢ双酶切,电泳显示约528bp,420bp处呈现明显条带,表明pMa1-c2x-cmvIL-10和pMa1-c2x-LA-cmvIL-10原核表达载体构建成功。　　 4、cmvIL-10和LA-cmvIL-10重组菌的诱导表达及纯化　　 用IPTG诱导重组蛋白表达,结果显示0.5 mmol/L IPTG在37℃诱导5 h能有效地诱导重组蛋白的表达,利用Amylose-resin亲和层析柱纯化目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析目的蛋白大小为62.5kDa和58.3kDa,结果与预期吻合。　　 5、cmvIL-10和LA-cmvIL-10抗血清的制备及鉴定　　 将纯化后的pMa1-c2x-cmvIL-10和pMa1-c2x-LA-cmvIL-10重组蛋白免疫家兔,制备多克隆抗血清,经Western blot证实,所制备的多克隆抗血清能与重组蛋白发牛特异性反应。　　 结论:　　 本实验成功建立了cmvIL-10利LA-cmvIL-10的原核表达体系,纯化表达产物,将此产物免疫家兔,获得特异性抗血清。经Western blot鉴定所表达的融合蛋白具有良好的抗原性和免疫反应性,为进一步深入研究HCMV编码的IL-10剪接体功能及作用打下了坚实的基础。