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高迁移率族蛋白B1(high-mobility group box-1,HMGB1)是广泛存在于真核生物细胞核内的染色体结合蛋白,其也存在于细胞质和细胞外,主要由A box、B box及酸性尾端三个结构域组成,具有多种生理和病理学作用。近年来研究表明,抗菌活性是HMGB1的一项新功能,然而其抗菌活性产生的机理尚未知。如能弄清HMGB1抗菌功能的结构基础,明确其参与抗菌作用的功能区域,不仅对深入探讨HMGB1抗菌活性发挥的具体功能位点及其结构与功能之间的关系具有重要的理论指导意义,而且可为进一步揭示HMGB1的抗菌机制奠定良好的基础。有文献报道天然人HMGB1有明确的抗菌活性,我们在实验过程中亦发现重组人HMGB1在适于表达“毒性”蛋白的原核表达系统pQE-80L/DH5α中表达量较低,而在其余一些原核表达系统中则不能表达;并且重组人HMGB1 A box、B box均无抗菌活性,我们推测HMGB1的酸性尾端对其抗菌活性的发挥可能有影响。为了证实这一推测,本实验表达、纯化了重组人HMGB1 A box及B box蛋白,继而克隆、表达并纯化了重组人HMGB1及其缺失酸性尾端的突变体蛋白;通过试管稀释法、琼脂扩散法两种抗菌实验观察并比较各组蛋白对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌(JM109、ATCC25922、DH5α)、绿脓杆菌的抗菌活性。为了解与人HMGB1具有高同源性的小鼠HMGB1是否也具有相同的抗菌活性,进一步克隆、表达并纯化重组小鼠HMGB1及其缺失酸性尾端的突变体蛋白,运用同样的抗菌实验观察并比较该两蛋白的抗菌活性。主要结果:1.表达人HMGB1 A box与DHFR融合蛋白、人HMGB1 B box与DHFR融合蛋白及DHFR蛋白。经Ni2+-NTA纯化系统,各目的蛋白得到了有效纯化。SDS-PAGE分析可见,分别在相对分子质量约为36×103、35×103、26×103处呈现单一条带。2.分别经RT-PCR成功地克隆了编码人、小鼠HMGB1的cDNA(即hHMGB1 cDNA、mHMGB1 cDNA)。测序后经查对,与GenBank上登录的编码相应人、小鼠HMGB1的cDNA序列完全一致。3.分别以获得的pUC19/hHMGB1、pUC19/mHMGB1为模板,经PCR致突变法获得其各自缺失酸性尾端的突变体DNA,分别命名为pUC19/mhHMGB1、pUC19/