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鸡白痢沙门菌(Salmonella enterica serovar Pullorum,Salmonella Pullorum)具有高度宿主专一性,引起的鸡白痢具有高发病率和高死亡率的特点,给养禽业造成了巨大的经济损失。沙门菌具有独特的感染细胞机制,从而保证其在宿主细胞内的生存。不同于志贺菌、李斯特菌逃避细胞内生物膜并在细胞质内复制的机制,沙门菌在宿主细胞内形成一种称为沙门菌囊泡(Salmonella-containing vacuole,SCV)的结构,沙门菌可在SCV中生存与增殖。目前,关于沙门菌SCV的研究主要以鼠伤寒沙门菌为模型,鸡白痢沙门菌SCV的相关研究较为匮乏。本研究主要对鸡白痢沙门菌感染细胞后形成SCV的规律进行研究。通过筛选研究鸡白痢沙门菌SCV的合适细胞模型与菌株,探索鸡白痢沙门菌在胞内形成SCV的规律,帮助更好地理解鸡白痢沙门菌与宿主细胞间的互作关系。同时,本研究建立了鉴定鸡白痢沙门菌T3SS效应蛋白功能的研究方法,为深入地研究鸡白痢沙门菌的致病机理提供了方案。1.鸡白痢沙门菌感染细胞模型的建立用鸡白痢沙门菌S06004分别感染HD-11、DF-1、DT-40和LMH四种禽类细胞系,测定其黏附率和侵袭率,结果表明,S06004对HD-11的黏附率与侵袭率最高,LMH次之,DF-1最低。S06004对DT-40的黏附率虽很高,但侵袭率比较低。因此,选择HD-11和LMH作为鸡白痢沙门菌感染的细胞模型更为适合。对1960s-2010s期间分离的50株鸡白痢沙门菌感染HD-11和LMH细胞的黏附率进行测定。结果表明,在HD-11细胞上,大部分菌株的黏附率与S06004相当,但7101、B8605、S9804和S9876的黏附率偏高,其中S9876的黏附率约是S06004的6倍;在LMH细胞上,大部分菌株的黏附率与S06004相当,但S08026、S9876和1306的黏附率偏高,并且S9876的黏附率约是S06004的4倍。在50株鸡白痢沙门菌中,S9876是唯一一株在LMH和HD-11上的黏附率均很高的菌株,因此,可作为研究鸡白痢沙门菌SCV形成规律的候选菌株。为了探索细菌对黏附率之间的关系,我们从50株鸡白痢沙门菌中挑选出黏附率差异明显的10株代表菌株,利用鸡胚模型进一步比较细菌的致病力。以103CFU/100μL的剂量尿囊腔接种16日龄的海兰白鸡胚。结果表明,尿囊腔接种C79-13、6803和6201菌株的鸡胚死亡数量最多,而S9876对鸡胚的毒力明显低于这三株。结合这三株细菌在HD-11和LMH上的黏附率,C79-13也可作为研究鸡白痢沙门菌SCV形成规律的候选菌株。我们进一步比较了C79-13与S9876对HD-11和LMH细胞的侵袭率,结果表明C79-13在两个细胞系上的侵袭率均高于S9876,因此,我们选择C79-13作为研究鸡白痢沙门菌SCV形成规律的模式菌株。2.鸡白痢沙门菌SCV的形成规律探索我们成功构建了表达GFP的鸡白痢沙门菌C79-13(pYA3334-GFP),选择EEA1作为早期SCV的标记蛋白,Rab7与Lamp1作为中期SCV的标记蛋白,以及Cathepsin D作为晚期SCV的标记蛋白,用激光共聚焦显微镜观察鸡白痢沙门菌C79-13在鸡肝癌上皮细胞系LMH细胞和禽巨噬细胞系HD-11细胞中各阶段SCV的形成时间。结果显示,在LMH细胞上,在5 min时约80%的细菌开始招募EEA1蛋白,形成早期SCV;在15 min时,细菌开始招募Rab7和Lamp1蛋白,形成中期SCV,且30 min时细菌招募Rab7的比例最高,而15 min时细菌招募Lamp1的比例最高;30-45 min时,部分细菌会招募成熟SCV的标记蛋白Cathepsin D,但在60 min时,蛋白招募现象尤为明显。在禽巨噬细胞系HD-11上,5-30 min时,可以观察到早期蛋白EEA1紧紧包围着细菌,且比例逐渐升高;15-45 min时,可以观察到中期蛋白Rab7将细菌包裹,且比例逐渐升高;中期蛋白Lamp1与晚期蛋白Cathepsin D没有将细菌包裹的现象,仅在30-60 min时,有些细菌招募Cathepsin D蛋白且比例逐渐下降。为证实激光共聚焦显微镜观察到的HD-11细胞中的结果,采用透射电镜直接观察细胞中SCV的形成。30 min时,细胞中可以很明显地看到不完整、不封闭的SCV;1h时,细菌分开,SCV的膜结构完整封闭,每个SCV只包含一个细菌;5 h时,一些SCV开始出现破损,并可观察到细菌的增殖及SCV的分裂。3.鸡白痢沙门菌T3SS2效应蛋白CigR对SCV的影响CigR是一个膜蛋白,由SPI3编码的T3SS2效应蛋白。有研究表明,cigR基因的缺失会引起沙门菌毒力的增强,但也有研究表明,cigR的缺失会导致其在鼠骨髓巨噬细胞内的增殖能力显著降低。为解析CigR对鸡白痢沙门菌SCV的影响,本研究采用λ-red同源重组系统成功构建了鸡白痢沙门菌C79-13的cigR基因缺失株C79-13△ciR,并初步解析了 CigR的功能。结果显示,cigR的缺失能够增强鸡白痢沙门菌在禽巨噬细胞HD11中的复制能力,并使细菌在胞内招募SCV标记蛋白Rab7的能力增强。