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研究背景和研究目的胆管癌根据其发生部位的差别,可以分为肝内胆管细胞癌和肝外胆管细胞癌。其中肝内胆管细胞癌的发生率要低于肝外胆管细胞癌,但是肝内胆管细胞癌起病隐匿,早期症状往往不明显,导致患者就诊时可能已经失去根治性手术切除的机会。而肝内胆管细胞癌对于目前的常规化疗药物敏感性欠佳,且患者耐受性较差,放射治疗也多只是姑息性治疗。因此,发现一种不良反应较轻且疗效显著的新药是十分必要的。双胍类药物是在糖尿病治疗中的常用药物,其安全性经过多年的验证是可靠的。流行病学资料显示,糖尿病与肿瘤患病率和死亡率相关,横断面及回顾性研究也提示,2型糖尿病患者服用二甲双胍可降低肿瘤患病率、提高化疗反应及减少病死率。与二甲双胍相似苯乙双胍也属于双胍类药物,也曾用于糖尿病的治疗,但由于其乳酸堆积的副作用较明显而禁用。然而,对于肿瘤治疗而言,苯乙双胍疗效更佳,并且肿瘤治疗与糖尿病治疗的标准亦有所不同。因此对于肿瘤治疗苯乙双胍是更好的选择。双胍类药物的作用靶点是AMPK,而AMPK是LKB1的直接底物,这也预示着LKB1的表达变化有可能对双胍类药物治疗肿瘤的效果产生重要影响。因此我们希望研究苯乙双胍对于肝内胆管细胞癌的抗癌作用,并通过LKB1–AMPK通路来研究苯乙双胍的抗癌机制及LKB1的表达状态对于苯乙双胍疗效的影响。研究方法1.CCK-8实验检测不同浓度的苯乙双胍对于肝内胆管细胞癌RBE、HuH-28细胞系的增殖抑制作用,并计算其IC 50;CCK-8实验检测相同浓度苯乙双胍不同作用时间对于RBE、HuH-28细胞的增殖抑制作用。2.以不同浓度苯乙双胍干预RBE、HuH-28细胞,用流式细胞仪检测其对凋亡的影响。3.以苯乙双胍干预RBE细胞,通过Western Blot检测苯乙双胍对LKB1、AMPK、p–AMPK蛋白表达的影响。4.以不同浓度苯乙双胍干预RBE、HuH-28细胞,用酶标仪检测两种细胞的培养基,检测其PH值、葡萄糖含量、乳糖含量的变化。5.分别用高糖、低糖、低糖加乳酸这三种培养基培养RBE、HuH-28细胞,并用苯乙双胍进行干预,检测不同培养基对苯乙双胍疗效的影响。6.用LKB1 SiRNA敲减RBE细胞的LKB1基因,并用Western Blot方法检测敲减效果。7.用ki67免疫荧光检测lkb1基因敲减对rbe细胞增殖的影响。8.以苯乙双胍干预野生型及lkb1敲减的rbe细胞,用cck-8检测苯乙双胍对两种细胞增殖的影响。9.以苯乙双胍干预野生型及lkb1敲减的rbe细胞,用流式细胞仪检测苯乙双胍对两种细胞凋亡的影响。10.以苯乙双胍干预野生型及lkb1敲减的rbe细胞,用westernblot检测两种细胞p-ampk的表达。11.以苯乙双胍干预野生型及lkb1敲减的rbe细胞,用westernblot检测两种细胞bax、cleaved–caspase3的表达。结果1.随着苯乙双胍浓度的增加,作用时间的延长,rbe、huh-28细胞的存活率逐渐降低,苯乙双胍对rbe、huh-28两种细胞的ic50分别为1138μm和854μm。2.随着苯乙双胍浓度的增加,rbe、huh-28细胞的凋亡率逐渐增加。3.rbe细胞接受苯乙双胍(500μm)处理12、24、36h之后,ampk的表达并无明显变化,lkb1的表达有增加但不明显,而p-ampk的表达明显增加。4.两种细胞的培养基随苯乙双胍的浓度增加均出现一定程度的酸化,糖含量均逐渐降低,乳酸含量均逐渐增加。5.对照组(不加苯乙双胍),无论在高糖、低糖还是低糖+乳酸的培养基中存活率都无显著差别,而实验组(苯乙双胍干预)在高糖、低糖、低糖+乳酸三种培养基下,细胞存活率依次下降。6.westernblot显示lkb1sirna干预的rbe细胞其lkb1的表达明显下降。7.lkb1敲减组的rbe细胞增殖更明显。8.lkb1敲减后的rbe细胞在无苯乙双胍干预时增殖较野生型增加。而使用苯乙双胍干预后,lkb1敲减的rbe细胞增殖速度显著低于野生型的rbe细胞。9.lkb1敲减后rbe细胞的凋亡率低于野生型的细胞。野生型和lkb1敲减的rbe细胞用苯乙双胍干预后凋亡率均增加,但lkb1敲减的rbe细胞凋亡率增加更明显。10.苯乙双胍干预下lkb1敲减型的rbe细胞p-ampk表达明显低于野生型rbe细胞。11.野生型rbe细胞与lkb1敲减的rbe细胞在苯乙双胍干预下均会增加bax、cleaved-caspase3基因的表达,但lkb1敲减的细胞增加更明显。结论通过本次实验,我们研究了苯乙双胍对于肝内胆管细胞癌RBE、HuH-28细胞增殖、凋亡、能量代谢的影响,并从LKB1-AMPK通路的角度研究了其作用机制。另外我们通过敲减LKB1基因发现其可以影响苯乙双胍对胆管癌的作用效果,并简单探讨了其可能的机制。我们得出以下结论:1.苯乙双胍可以抑制肝内胆管细胞癌RBE、HuH-28细胞的增殖,并增加其凋亡,并且这一作用呈现时间剂量依赖性。2.苯乙双胍能活化AMPK,使之成为磷酸化的AMPK(p-AMPK),苯乙双胍的抗癌作用可能与LKB1–AMPK通路有关。3.随着苯乙双胍浓度的增加,细胞合成代谢受抑制,分解代谢增强,糖酵解增加,代谢产物堆积,培养基酸化。处于低糖,代谢产物堆积微环境中的细胞对苯乙双胍更敏感。4.LKB1为一抑癌基因,LKB1敲减后RBE细胞增殖加快。5.LKB1表达降低的细胞对苯乙双胍更敏感,而苯乙双胍增加LKB1敲减型细胞凋亡增加的原因可能与Bax、cleaved–caspase3表达增加有关。