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类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是最常见的免疫系统紊乱性疾病之一,常常引起关节疼痛、肿胀以及全身性慢性疾病,全球大约有2千万患者。T细胞在这一过程中发挥了关键性的作用,抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APC)通过主要组织相容性复合体(major histo-compatibility complex,MHC)和免疫共刺激分子双信号激活T细胞,通过信号级联反应促进多种细胞因子,如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL)和干扰素(interferon,IFN)等的释放,从而导致骨骼、关节等组织的损伤。常用药物为Adalimumab(ADA),Etanercept(ETN),Infliximab(IFX),Rituximab(RTX),Tocilizumab(TOC)以及Abatacept(ABT)。它们的作用机理主要分为两类:其一,针对级联反应终末期的细胞因子,阻断其发挥生物学功能,从而减少骨骼、关节等组织的损伤,如ADA、ETN、IFX等;其二,针对反应的启动阶段,阻止T细胞的激活,从而在源头阻断免疫级联反应的发生,其典型代表为ABT。ABT在2005年被FDA批准用于治疗顽固性RA,已经过十余年的临床应用,安全性和有效性获得确认。本文的研究对象,ABT是一个融合蛋白,又叫CTLA4-Ig,由细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4,CTLA4)的胞外段和修饰的Ig G1抗体Fc(铰链区、恒定区2和恒定区3)组成。其通过CTLA4与APC上的白细胞分化抗原80(cluster of differentiation 80,CD80,B7-1)或者白细胞分化抗原86(cluster of differentiation 86,CD86,B7-2)结合竞争T细胞上的CD28,从而阻断T细胞的活化,进而抑制免疫级联反应,导致IL和TNFα等细胞因子释放减少,这些细胞因子在RA的发生发展过程中发挥了非常重要的作用。因而,ABT在RA的治疗中获得了良好的效果。相比小分子化学药物,蛋白类药物具有明显的自身优势,比如特异性好,副作用低,体内靶向分布,并且能够通过多种途径发挥治疗作用。但是,由于蛋白类药物都是在哺乳动物细胞内表达、分子量大、结构复杂、含大量的翻后修饰,以及生产工艺复杂等特点,使得制药公司在对其进行质量研究及产品放行的难度加大。大量的研究发现翻译后修饰对蛋白质的结构和功能具有重要的影响,例如抗体类药物Fc上的N糖,除了对抗体的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)和补体依赖的细胞毒作用(complement-dependent cytotoxicity,CDC)具有重要的影响外,还对抗体的结构、稳定性及酶的敏感性方面也具有重要影响。而CTLA4-Ig作为融合蛋白既有可结晶片段(crystallizable fragment,Fc)部分,也有CTLA-4胞外段,这两部分都存在复杂的糖基化修饰。虽然FDA在2005年就已批准用于临床,但是对其糖基化修饰研究报道很少,并且其还存在复杂的O-糖基化修饰;再者糖基化修饰对其结构、稳定性和功能影响的研究未见报道。本课题详细表征CTLA4-Ig融合蛋白的糖基化修饰,进而明确这些糖基化修饰与其稳定性和功能间的关系,为CTLA4-Ig融合蛋白的质量控制提供参考,同时为CTLA4-Ig生物类似药研究打下基础。本课题采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱(ultra performance liquid chromatography-electrospray ionization-quadrupole-time of flight,UPLC-ESI-Q-To F)、差示扫描量热(differential scanning calorimetry,DSC)、分子排阻色谱(size exclusion chromato graphy,SEC)、差示扫描荧光(differential scanning fluoroscopy,DSF)、Forte Bio结合活性,以及细胞生物学活性等技术,从糖基化修饰水平对CTLA4-Ig融合蛋白进行了全面的表征分析;并通过应用多种酶对CTLA4-Ig融合蛋白进行处理,在此基础之上,应用多种检测手段对CTLA4-Ig融合蛋白的稳定性和功能进行了研究。具体研究路线如下:糖基化修饰表征分析部分:在完整蛋白水平,因CTLA4-Ig融合蛋白含有多个N-糖基化和O-糖基化修饰,质谱无法获得有效信息;在亚单位水平,为了降低蛋白的复杂性以获得更加详尽的信息,我们应用了多种酶(PNGase F、Endo F2、Neuraminidase和O-Glycosidase)对样品进行处理,然后应用质谱进行检测;在质量肽图谱水平,通过胰酶对样品进行处理后,应用质谱进行检测;在游离N-寡糖水平,首先应用PNGase F酶切获得游离N-寡糖,标记2AB,应用荧光和质谱对N-糖谱分别进行定量和定性分析;其次应用Ides酶将蛋白分为两部分,应用游离N-寡糖相同的检测手段,对两部分的N-寡糖水平分别进行表征;在O-糖修饰水平,应用糖苷酶(PNGase F)、唾液酸酶(Neuraminidase)和胰酶(Trypsin)处理样品,获得保留O-糖核心糖单元修饰的肽段,应用LC-MS/MS对O-糖基化进行定位研究。糖基化与稳定性和功能关系部分:我们应用了多种糖苷酶(PNGase F、Endo F2、Neuraminidase和O-Glycosidase)对样品进行处理,并从酶切系统中分离纯化出了处理后的CTLA4-Ig融合蛋白,以进行后续实验研究。在稳定性方面:第一,通过SEC测定不同酶切时间处理前后样品纯度的变化;第二,应用0.22um的滤膜除菌后,进行45℃下的加速实验,在0、1、3、5、7、9、11和12周取样,通过SEC测定样品纯度的变化;第三,应用DSF测定不同时间酶切处理后,样品整体热力学参数的变化;第四,应用DSC测定不同时间酶切处理,样品各结构域热力学参数变化。在功能方面:对于Fc段结合活性,我们选择报告基因法测定了酶切样品与Fc受体的结合活性变化,也间接体现了CTLA4-Ig蛋白的ADCC活性变化;对于CTLA4段结合活性,我们应用Forte Bio技术,分别测定酶切前后样品与B7-1和B7-2的亲和力;对于细胞生物学活性,我们选择报告基因法测定酶切样品,阻断Duadi细胞结合并激活Jurkat细胞的能力,以评估其生物学活性。本研究证明,通过CHO表达系统培养获得的CTLA4-Ig蛋白,含有非常复杂的糖基化修饰:其中6个N糖基化修饰,位于CTLA4段的4个N糖基化修饰相对比较复杂,含有大量的末端唾液酸修饰,而位于Fc段的两个N糖基化修饰相对比较简单,与经典的单克隆抗体的糖基化修饰相似;研究结果明确了O糖基化修饰的个数和位置,分别为铰链区肽段上的第2、8、11和20位的丝氨酸,存在O糖基化修饰;并通过质谱强度,初步确定了含不同O糖基化修饰个数的比例。通过不同的糖苷酶处理,明确了糖基化修饰对CTLA4-Ig稳定性有显著的影响,而对其结合活性以及细胞活性未见明显的影响。通过以上研究,我们对CTLA4-Ig蛋白的糖基化修饰有了全面的了解,为该药物的质控提供了很好的基础,同时也为其生物类似药研发提供参考。