性别控制技术在畜禽生产、育种等方面都能够发挥重要作用,其发展对畜牧业影响重大,但目前的主要性别控制技术,如流式分选精液技术、早期胚胎性别鉴定、体细胞克隆等虽然具有一定的性控效果,但也存在成本高、技术难度大等一系列的问题,无法广泛和大规模的应用于畜禽生产。因此,本实验根据已有的研究结果,采用CRISPR/Cas9系统靶向切割性染色体多拷贝序列,并使其在特定时期表达,从而减少某一性别的精子或胚胎数量从而实现性别控制。本研究设计了靶向小鼠X染色体X-B和X-D两个多拷贝位点的sg RNA X-B和sg RNA X-D,成功构建了不同启动子控制的CRISPR/Cas9共表达载体,CMV启动子控制的CMV载体可以在任何组织任何时期表达,鱼精蛋白启动子控制的鱼精蛋白载体只能在精子生成后期表达。为了对设计的sg RNA的切割效率进行验证,将sg RNA体外转录与靶序列、Cas9蛋白共同反应验证其对靶序列体外切割效率;同时以CMV载体为实验组,鱼精蛋白载体为对照组在细胞水平和胚胎水平进行验证。结果表明:利用体外转录sg RNA切割PCR扩增的靶序列,两条sg RNA的切割效率均能达到60%以上;在细胞水平,CMV载体和鱼精蛋白载体转染小鼠雄性MLTC-1细胞48小时后,转染CMV载体组较转染鱼精蛋白载体组绿色荧光细胞比例显著下降,从56%下降至15.5%,这表明共表达载体在雄性细胞中具有较高的切割致死效率;CMV载体转染MLTC-1细胞的单克隆细胞团中,突变效率也能够达到11.1%;将CMV载体和鱼精蛋白载体分别注射小鼠孤雌胚胎,注射CMV载体的囊胚率有一定的下降但没有显著差异,但是注射CMV载体组的囊胚细胞数相比注射鱼精蛋白载体组的囊胚细胞数显著下降,这从侧面证明注射的质粒在部分卵裂球中可能发挥了切割作用并且导致细胞死亡;通过荧光定量PCR检测X染色体上单拷贝基因Xist在转染载体一的C127单细胞克隆团样品中的拷贝数,将雌性C127细胞DNA和雄性MLTC-1细胞DNA作为对照,比较样品与对照Ct值,筛选出15个可能的X染色体缺失细胞团,进一步采用SNP法鉴定后获得了12个XO型单克隆细胞团。由此,我们可以得出结论,本实验成功筛选了靶向小鼠X染色体多拷贝基因的sg RNA,并且成功构建了具有高效切割效率的靶向小鼠X染色体的CRISPR共表达载体。