前言：　　在真核生物细胞周期的各个事件中，DNA复制过程是一个被严格调控的事件，受到G1/S限制点的检查，与细胞周期其他事件协调发生。DNA复制的紊乱将直接导致基因组不稳定，与肿瘤的发生、发展息息相关。DNA聚合酶alpha-引物酶复合物（DNA polymerase alpha-primase，pol-prim）是负责DNA复制起始的聚合酶。该酶由四个亚基组成，其中p180有聚合酶活性，p70调控pol-prim活性，p180在整个细胞周期中均处于磷酸化状态，p70以细胞周期依赖性方式被磷酸化，从而活化pol-prim。周期素(cyclin)E/细胞周期依赖性激酶2(cell cycle dependent kinase2，CDK2)在S期复制起始阶段磷酸化p70，激活pol-prim。　　口腔癌缺失基因-1相关基因（deleted in oral cancer-1-related，DOC-1R）是张学教授等发现的一个抑癌基因。RT-PCR结果表明，DOC-1R在所检测的小鼠各组织中普遍表达，在卵母细胞中也有表达，提示DOC-1R可能是哺乳动物的管家基因。本课题组前期工作发现，DOC-1R转基因表达明显地抑制了细胞体外集落形成能力，提示DOC-1R对细胞增殖有抑制作用。细胞生长曲线和5-溴-2脱氧尿嘧啶核苷（5-Bromo-2deoxyuridine，BrdU）掺入实验表明，DOC-1R转基因表达能够抑制体外培养细胞的生长，并明显抑制其DNA复制过程。　　Wong等研究表明DOC-1R的同源蛋白，口腔癌缺失基因-1（deleted in oralcancer-1，DOC-1），能够分别和pol-prim及CDK2结合，通过抑制CDK2/cylin E对p70的磷酸化，从而抑制DNA复制起始。氨基酸序列比对发现在与CDK2及pol-prim两蛋白结合区域，DOC-1蛋白和DOC-1R蛋白的相应区域高度同源。因此，我们推测DOC-1R蛋白可能也结合CDK2和pol-prim，并抑制两者活性从而抑制DNA复制起始。本实验根据以上假设展开DOC-1R负性调节DNA复制的机理研究。　　材料与方法：　　1、pLXSN-FLAG-1R及pLXSN-FLAG逆转录病毒载体的构建　　两端带有EcoR I/BamH I酶切位点的FLAG-DOC-1R以及FLAG插入片段分别通过PCR扩增和人工合成获得。用EcoR I/BamH I双酶切消化pLXSN载体及插入片段。连接酶切后的载体和插入片段，并转化感受态细胞，经菌落PCR及限制性内切酶酶切鉴定得到候选阳性克隆，测序以证实构建成功。　　2、流式细胞分析仪检测DOC-1R对细胞周期的影响　　逆转录病毒载体pLXSN-FLAG-DOC-1R以及pVSV-G，以LipofeetamineTM2000共转染GP-293细胞，在GP-293细胞中进行病毒包装。转染48 h后，过滤细胞培养液上清，以收集病毒。HeLa细胞感染病毒48 h后，应用PI染料通过流式细胞分析仪检测实验组和对照组的细胞周期时相分布，记录位于各期的细胞百分率。三次结果取平均值，经统计学分析，比较实验组和对照组细胞周期分布差异。　　3、免疫沉淀方法分析DOC-1R与CDK2蛋白的相互作用　　逆转录病毒感染HeLa细胞后48 h裂解细胞，细胞裂解液中加入FLAG抗体，4℃摇动过夜。次日加入30μl protein G Beads混合3h，洗脱液洗Beads5次，后离心沉淀Beads。Western印迹检测共沉淀的CDK2蛋白。　　4、DOC-1R对细胞内CDK2蛋白激酶活性的影响　　以CDK2抗体经免疫沉淀(immunoprecipitation，IP)从DOC-1R病毒感染细胞裂解液和对照组中纯化CDK2蛋白，150μg总蛋白中纯化的CDK2蛋白溶解于15μl激酶反应缓冲液中，加入ATP与底物histone H1在30℃孵育90 min，加入激酶活性检测试剂Kinase GloTM室温孵育10 min后，发光仪检测发光强度，并经统计学分析确定DOC-1R表达对CDK2活性的影响。　　5、免疫沉淀方法分析DOC-1R与pol-prim p180的相互作用　　逆转录病毒感染HeLa细胞后48 h裂解细胞，细胞裂解液中加入FLAG抗体，4℃摇动过夜。次日加入30μl protein G Beads混合3h，洗脱液洗Beads5次，后离心沉淀Beads。Western印迹检测共沉淀的pol-prim p180。　　6、DOC-1R对pol-prim活性的影响　　以p70抗体经免疫沉淀从DOC-1R病毒感染组细胞裂解液和对照组细胞裂解液中纯化p70蛋白后，以Western印迹分别检测磷酸化的p70及p70总蛋白。Western印迹结果经灰度值扫描后，以磷酸化p70灰度值相对p70总蛋白灰度值的比值phospho-p70/p70/p70代表相对磷酸化程度，p70的磷酸化程度高则反应pol-prim活性强。　　实验结果：　　1、pLXSN-FLAG-DOC-1R和pLXSN-FLAG逆转录病毒载体的构建　　以菌落PCR及限制性内切酶酶切鉴定得到候选阳性克隆，测序结果表明所得到的克隆序列及开放阅读框架完全正确。　　2、流式细胞分析仪检测DOC-1R对细胞周期的影响　　(1)与对照组相比，感染DOC-1R逆转录病毒的实验组细胞中，G1期细胞比率增加，S期细胞比率减少。经t检验分析，其差异具有统计学意义，P＜0.05。　　(2)M期细胞比率在实验组与对照组间的差异没有统计学意义。　　3、免疫沉淀证实DOC-1R与CDK2在细胞内结合　　以DOC-1R逆转录病毒感染HeLa细胞，以pLXSN-FLAG产生的逆转录病毒感染对照组HeLa细胞。以抗-FLAG抗体进行免疫沉淀，CDK2抗体进行Western印迹分析。实验组检测到CDK2，而对照组未检测到CDK2蛋白。证明DOC-1R与CDK2在细胞内结合。　　4、体外激酶活性检测表明DOC-1R下调CDK2的激酶活性　　感染DOC-1R逆转录病毒的细胞中，相对荧光单位(relative light unit，RLU)为17731，感染对照逆转录病毒细胞的RLU为12283，经t检验分析，此差异在统计学上具有显著性，P＜0.01。　　5、免疫沉淀证实DOC-1R与pol-prim p180在细胞内结合　　以DOC-1R逆转录病毒感染HeLa细胞，以pLXSN-FLAG产生的逆转录病毒感染对照组HeLa细胞。以抗-FLAG抗体进行IP，pol-prim p180抗体进行Western印迹分析。实验组检测到pol-prim p180，而对照组未检测到pol-prim p180蛋白。证明DOC-1R与pol-prim p180在细胞内结合。　　6、DOC-1R对pol-prim活性的影响　　感染DOC-1R逆转录病毒的细胞中，phospho-p70/p70比值为0.242;感染对照逆转录病毒细胞的phospho-p70/p70比值为0.735。经t检验分析，此差异在统计学上具有显著性，P＜0.01。DOC-1R抑制p70的磷酸化，从而抑制pol-prim的复制起始活性。　　结论：　　DOC-1R是CDK2结合蛋白，负调控CDK2活性，抑制细胞周期G1/S期转换。DOC-1R与pol-prim在细胞内结合，通过结合直接抑制pol-prim活性或者负调控CDK2介导的pol-prim p70磷酸化，进而抑制了pol-prim的复制起始活性。