三妙丸(Sanmiao Wan,SMW)源于二妙丸(治疗痛风的基础方),首次记载见于《医学正传》(虞抟,明代)一书,因其具有清热、燥湿、消肿、止痛等功效,一直作为中医治疗关节痹病的常用方剂使用,且在《中国药典》历版中均有收录。三妙丸方由黄柏、苍术和牛膝按照质量比例2:3:1组成。方中黄柏为君药,起主要治疗作用,且不可或缺,其抗炎活性成分以小檗碱、药根碱、巴马汀等原小檗碱型生物碱类为主;苍术为臣药,辅助君药发挥药效,其有效成分为挥发油类(β-桉叶醇,苍术素等);牛膝为佐使药,引药下行,能够引导苍术、黄柏入下焦或下肢,促进三妙丸中其他有效成分向下肢靶组织或器官分布,尤其能提高病位在下肢的疾病的疗效,其有效成分主要是分为两类:甾酮类(β-蜕皮甾酮、25-R牛膝甾酮)和三萜皂苷类(竹节参皂苷IVa,三七皂苷R1)。基于三妙丸临床主要用于治疗痛风和高尿酸血症,本文运用尿酸钠晶体诱导的痛风模型和次黄嘌呤诱导的高尿酸血症模型,通过药效学和有效成分的组织分布研究相结合,旨在研究三妙丸方中牛膝的引药下行作用。本研究选择小檗碱和药根碱等两种生物碱作为黄柏的有效指标成分,建立一种灵敏、可靠的超高效液相-质谱联用方法同时测定多次给药三妙丸去牛膝组和三妙丸含牛膝组后,大鼠血浆和组织(心、肝、脾、肺、肾、膝关节、踝关节)中小檗碱和药根碱成分的分布情况,并结合给药后对急性痛风性关节炎大鼠膝关节肿胀程度、关节滑膜组织增生、炎细胞浸润等药效学特点,探讨牛膝引药下行在痛风性关节炎模型中所起的作用。具体研究工作如下:第一部分牛膝“引药下行”对三妙丸治疗大鼠急性痛风性关节炎和高尿酸血症的影响本研究通过比较三妙丸去牛膝组和三妙丸含高、中、低剂量牛膝组给药后对急性痛风性关节炎和高尿酸血症大鼠的疗效,证明牛膝引药下行对提高三妙丸药效的影响。普通级雄性SD大鼠,随机均分为6组:对照组、模型组、三妙丸去牛膝组(10 g/kg)、三妙丸牛膝低剂量组(12 g/kg)、三妙丸牛膝中剂量组(14g/kg)和三妙丸牛膝高剂量组(18 g/kg)。四组药物治疗组大鼠连续灌胃给药5天。于第2天灌胃后造模,即向模型组和四组给药组大鼠的膝关节腔内注射尿酸钠混悬液(0.2 m L,20 mg/m L),建立急性痛风性关节炎模型,观察三妙丸去牛膝组和三妙丸含牛膝组对实验性急性痛风性关节炎大鼠膝关节造模前后直径的变化和膝关节组织病理形态学影响的差异性。腹腔注射次黄嘌呤(700 mg/kg)制备大鼠高尿酸血症模型,并观察给药三妙丸去牛膝组和三妙丸含牛膝组对血清尿酸水平的影响。结果表明,与对照组比较,大鼠关节腔注射尿酸钠混悬液后,模型组大鼠的膝关节肿胀明。HE染色结果表明,模型组滑膜增生和炎症细胞浸润严重;与模型组比较,各给药组肿胀度,滑膜增生和炎细胞浸润情况均有不同程度的减轻,且三妙丸含牛膝组较三妙丸去牛膝组疗效明显,在三妙丸含牛膝组中,随着牛膝剂量增加,疗效逐渐得到提高。各组给药后均能降低高尿酸血症大鼠血清尿酸水平,其中三妙丸含牛膝组给药后降尿酸作用较去牛膝组好。而且随着牛膝剂量的增加,大鼠血清尿酸水平呈现逐渐降低的趋势。因此,三妙丸含引药下行之牛膝能进一步改善大鼠急性痛风炎症状态,表现更强的降尿酸作用。更重要的是,本研究中亦观察到牛膝引药下行具有剂量依耐性。牛膝作为下肢疾病的引经药,有利于实现其他药物的下肢靶向给药。本文研究结果为牛膝引药下行作用的临床应用提供依据。第二部分运用UPLC–MS/MS研究牛膝“引药下行”对三妙丸中小檗碱和药根碱的组织分布的影响本研究旨在探讨三妙丸方中牛膝引药下行作用对君药黄柏有效成分小檗碱和药根碱在大鼠体内血浆和组织分布的影响。四组给药组大鼠连续五天分别灌胃给药三妙丸去牛膝组(10 g/kg)、三妙丸牛膝低剂量组(12 g/kg)、三妙丸牛膝中剂量组(14 g/kg)和三妙丸牛膝高剂量组(18 g/kg)后,采用UPLC-MS/MS法测定大鼠血浆和心、肝、脾、肺、肾、膝关节、踝关节等组织中生物碱类成分的分布情况。液相色谱仪使用岛津Inertsil ODS-3/C18色谱柱(50×2.1 mm I.D.,2μm),以1%甲酸水(A相),乙腈(B相)进行梯度洗脱,流速0.3 m L/min。使用AB SCIEX 5500三重四级杆质谱仪,电喷雾离子源(ESI),采用多反应监测(MRM)模式。结果表明,与三妙丸去牛膝组比较,给药三妙丸含低、中、高剂量牛膝组后,血浆小檗碱浓度分别增加19.81%,143.40%和681.13%,三妙丸含牛膝组大鼠体内小檗碱在心、肺等组织中分布较去牛膝组减少,在肝、肾等组织中分布较去牛膝组增多。更有趣的是,牛膝明显增加小檗碱在下肢(膝关节、踝关节)的分布,其中小檗碱在靶组织膝关节中的浓度分别增加了6.53%,44.31%和212.96%。此外,药根碱的变化趋势和小檗碱类似。牛膝引药下行作用体现在能明显小檗碱和药根碱在下肢(膝关节和踝关节)或下焦(肝、肾等)组织中的分布,减少其在上焦(心、肺等)组织中的分布,且牛膝的引药下行之功与其剂量呈正相关。