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在肉鸡养殖过程中,畜牧工作者长期偏重生产性能选育的同时也引发了肉鸡腹脂沉积过度等问题,这不仅影响家禽的肉、蛋产量和品质,也会导致饲料转化率下降,屠宰加工费用增高。另一方面,由其引发的一系列脂代谢紊乱相关疾病也给畜牧业造成巨大经济损失。肉鸡历经不断的选育过程,现有的饲养标准和营养需要量推荐值是否能满足现阶段肉鸡的生长需要?是否正是因为动物自身实际营养需要与饲养标准之间的偏差才导致了这些问题的出现?叶酸作为B族维生素,可参与一碳单位的代谢进程,调控动物机体的脂代谢。不同动物之间脂代谢的模式和调控机制也存在很大差异。基于此,本试验在探究鸡胚和出壳后一周内肝脏脂代谢的动态变化规律基础之上,通过体外鸡原代肝细胞分离培养,并借助代谢组和蛋白组技术探究叶酸调控鸡原代肝细胞脂质代谢的机制,并在肉鸡饲养过程中通过叶酸灌喂技术进一步验证叶酸对肉鸡脂代谢的影响,旨在为家禽脂代谢紊乱相关疾病的预防以及叶酸在鸡饲粮的合理有效应用提供理论基础和科学依据。试验1鸡胚及肉仔鸡早期肝脏脂代谢动态变化规律本试验旨在明晰鸡胚孵化期及雏鸡出壳后一周内肝脏脂代谢的动态变化规律。从鸡胚孵化的第11天(E11)至雏鸡出壳后第7天(D7),每天选取7枚蛋重和大小相近的鸡蛋或7只雏鸡,对鸡胚或雏鸡及肝脏进行称重,并剪取少许肝脏样品置于多聚甲醛固定,以备后续切片制作进行形态学和脂质含量观察,其余肝脏样品冻存用于后续的脂代谢分析检测。结果发现:鸡体重和肝脏重量随着时间逐渐增加(P<0.05),肝脏指数在孵化期较低,出壳之后快速增加(P<0.05);肝脏石蜡切片HE染色和冰冻切片油红O染色显示肝脏脂滴含量从鸡胚孵化期开始逐渐增加,但出壳之后又逐渐下降;ELISA检测分析也揭示肝脏胆固醇(TC)含量在E19和D1达到最高(P<0.05),肝脏TC与甘油三酯(TG)的含量总和在雏鸡出壳前同样达到最高(P<0.05);肝脏ACC、FAS、SCD1和SREBP的基因表达在孵化期逐渐升高,至E19达到峰值,出壳后表达下降(P<0.05);ELOVL6和MTTP在胚期表达量均较低,但出壳后其m RNA丰度处于较高水平(P<0.05),但肝脏CPT1、PPARα和Ch REBP的表达与其相反,它们在胚期表达量高,出壳后显著下降(P<0.05)。上述结果表明,肝脏脂质合成代谢相关基因在鸡胚和雏鸡第一周内各自有不同的表达模式,在胚期和出壳后可能受不同转录因子的激活调控;1日龄雏鸡肝脏的脂质含量高,脂肪酸从头合成能力强,β氧化弱,与脂代谢紊乱的特征类似,用其进行鸡原代肝细胞分离,可能是体外开展脂代谢相关研究的良好模型。试验2肝细胞分离培养鉴定及叶酸调控其脂代谢的剂量选择本试验旨在建立鸡原代肝细胞培养条件并研究叶酸对其脂质代谢相关基因表达的影响,为体外探究叶酸调控家禽脂质代谢机制提供依据。采用酶消化法分离鸡原代肝细胞,用高碘酸希夫氏染色方法进行肝细胞鉴定;待肝细胞生长融合至80%左右时,分为6个处理组,分别更换含不同叶酸浓度的培养基(0、1、5、10、15、20 mg/L),每个叶酸浓度6个重复,处理12 h后收集上清液,并提取细胞RNA以待检测基因相对表达量。结果表明,采用酶消化法分离得到的肝细胞在培养初期呈典型上皮细胞样的多角形,然后细胞集落相互接触出现连接汇合,随后呈岛屿状并连接融合成片;不同剂量的叶酸没有影响肝细胞培养液中的LDH活性(P>0.05),也没有对肝细胞的增殖产生影响(P>0.05);与1 mg/L剂量的叶酸对照组相比,10、15和20 mg/L的叶酸显著降低了肝细胞脂质合成代谢有关的ACC和FAS基因的表达(P<0.05),但叶酸并没有对鸡肝细胞中与脂质分解代谢有关的CPT1和PPARα基因的表达产生影响(P>0.05);并且鸡肝细胞中ACC和FAS基因的表达与叶酸剂量也存在着线性和二次曲线的回归关系(P<0.05)。综上表明,添加10、15和20 mg/L的叶酸添加可降低鸡原代肝细胞中与脂肪酸合成相关基因的表达,15 mg/L添加剂量效果最佳。试验3基于组学技术揭示叶酸对鸡原代肝细胞脂代谢的影响基于试验二中筛选的叶酸添加浓度,本试验旨在利用组学技术揭示叶酸对鸡原代肝细胞脂质代谢的影响。选择新生雏鸡分离得到原代肝细胞,试验分为对照组和叶酸添加组,每个处理6个重复,处理12 h后,收集细胞进行蛋白组和代谢组分析,并检测脂质代谢相关生生化指标。蛋白组结果分析显示,与对照组相比,共筛选鉴定到81个差异蛋白,其中显著下调的蛋白有26个,包括脂肪酸合成酶(FAS)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K),上调蛋白共55个,包括甘油三酯水解酶(ATGL)和微粒体甘油三酯转运蛋白(MTTP)(P<0.05);代谢组结果分析表明叶酸添加显著下调了20个代谢物的含量,上调的差异代谢物共25个,并且基于差异代谢物的通路分析显示氨基酸类代谢和脂代谢通路被显著富集(P<0.05);油红O染色定量分析表明叶酸的添加显著降低了肝细胞内的脂质含量(P<0.05);除此之外,与对照组相比,叶酸添加组的细胞内甘油肝脏含量显著降低,但游离脂肪酸(NEFA)和极低密度脂蛋白(VLDL)显著升高(P<0.05);但叶酸的添加并没有影响糖原、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)和载脂蛋白(apo)的含量(P>0.05)。研究表明,叶酸可以抑制脂肪酸的从头合成,促进甘油三酯的水解和脂质的胞外转运,从而降低肝细胞内的脂质沉积,但具体的调控机制有待进一步研究。试验4叶酸调控鸡原代肝细胞脂代谢的机制探究本试验旨在进一步探究叶酸调控鸡原代肝细胞脂代谢的机制。试验设计同试验三,首先检测脂代谢相关通路因子的蛋白表达,随后通过IGF2重组蛋白、IGF2抑制剂、PI3K/AKT通路抑制剂LY294002的添加进一步验证叶酸的调控机制。结果显示,叶酸的添加显著降低了细胞内IGF2、IR、IGF1、AKT2、SREBP-1c、ACC和FAS的基因表达(P<0.05),并且叶酸组的IGF2、PI3K85、PI3K110、p-AKT、SREBP和FAS的蛋白表达也显著低于对照组(P<0.05)。IGF2抑制剂的添加显著降低了细胞内TG的含量(P<0.05);IGF2重组蛋白的添加提高了ACC、FAS、SCD和SREBP的基因表达,并且提高了PI3K85、PI3K110、p-AKT、SREBP和FAS的蛋白表达(P<0.05);相反地,IGF2抑制剂的添加显著降低了IGF2和脂肪酸从头合成相关基因的表达,并且下调了细胞内IGF2以及PI3K/AKT/SREBP通路相关因子的蛋白水平(P<0.05);PI3K/AKT抑制剂LY294002的添加显著降低了肝细胞内TG的含量,以及PI3K85、PI3K110、p-AKT、SREBP和FAS的蛋白水平(P<0.05),并且显著抑制了IGF2重组蛋白对上述分子蛋白表达的上调作用(P<0.05);除此之外,叶酸的添加显著提高了细胞内游离叶酸和5-Me-THF的含量(P<0.05),与对照组相比,叶酸组5m C和IGF2启动子区的甲基化水平显著提高,但DNMT3A和DNMT3B的基因表达显著下调(P<0.05)。综上所述,叶酸的添加可通过提高基因启动子区甲基化而下调IGF2的表达,减弱胞内Insulin/IGF信号,进而削弱PI3K/AKT/SREBP通路,最终抑制鸡原代肝细胞内的脂质合成代谢。试验5叶酸灌喂调控肉仔鸡脂代谢的机制探究在前期的细胞基础上,本试验旨在探究叶酸对肉仔鸡生产性能和脂代谢的影响。试验选取105只1日龄健康雏鸡,随机分成3个处理组,每组7个重复,每个重复5只鸡,分别为对照组、生理盐水灌喂组和叶酸灌喂组,饲养结束后,统计生产性能,检测血清生化指标,并对肝脏和腹脂的脂代谢情况进行分析。结果显示,叶酸灌喂显著降低了肉鸡腹脂率(P<0.05),但对体重、平均日采食量、平均日增重和饲料转换率无显著影响(P>0.05);与对照组相比,叶酸灌喂显著降低了十二指肠和空肠RFC的表达,上调了FR的表达(P<0.05);叶酸组血清TG、TC和ALT显著降低,白蛋白水平显著升高(P<0.05);叶酸组肝脏ACC、SCD、ELOVL6、PI3K、LDLR、MTTP、HMGCR和ABCA1的m RNA水平显著低于对照组和生理盐水组(P<0.05),但CPT1和PPARα在各处理组之间无显著变化;另外,叶酸灌喂显著提高了肝脏LDL的含量(P<0.05),但对其他脂代谢生化指标例如HDL、VLDL、TG、TC、HDL-c、LDL-c等无显著影响,HE和油红染色显示肝脏脂质沉积也无显著差异(P>0.05);另一方面,与对照组相比,腹脂ELOVL6、PPARγ、IGF1、TGFβ2的m RNA水平在叶酸灌喂组显著下降(P<0.05)。研究表明,叶酸显著抑制了肉鸡肝脏内脂肪酸和胆固醇的合成,并且通过下调IGF1和TGFβ2的表达抑制腹脂内脂肪细胞增殖,进而降低了肉鸡腹脂沉积。综上所述,肝脏脂质合成代谢相关基因在鸡胚和雏鸡具有不同的表达模式,雏鸡肝脏脂代谢特点与脂代谢紊乱特性相似,是作为原代肝细胞分离并进行脂代谢异常体外研究的良好模型;叶酸可以介导Insulin/IGF信号通过PI3K/AKT/SREBP通路抑制鸡原代肝细胞脂质合成代谢,促进脂质水解和胞外转运,缓解肝细胞内的脂质积累,在体的叶酸灌喂可改善肉仔鸡血脂代谢和肝功能,减少肝脏脂质从头合成同时抑制腹脂组织中脂肪细胞的增殖和分化,从而减少肉仔鸡的腹脂沉积。