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普鲁兰酶是解支酶的一种,它可以水解支链淀粉中的α-1,6糖苷键。将它和其他淀粉酶共同使用将大大提高淀粉的利用率,降低食品、饲料和医药等工业的生产成本,因而受到人们重视。本文通过普鲁兰酶筛选平板发现实验室原有菌株Nws-pp2可以水解普鲁兰多糖产生明显的水解圈,经过细菌生理生化试验和16S rDNA序列分析得知这是一株多粘类芽孢杆菌。通过设计简并引物从多粘类芽孢杆菌Nws-pp2中克隆了Ⅰ型普鲁兰酶基因的全长并命名为pu1N,该普鲁兰酶基因包含2532个核苷酸,编码843个氨基酸。氨基酸序列的最高相似性为98%,属于糖苷水解酶13家族。通过构建重组质粒,将普鲁兰酶编码基因分别克隆进大肠杆菌表达系统和枯草芽孢杆菌表达系统。重组的工程菌都成功表达了该外源基因,其中酶活最高的是大肠杆菌BL21-pET28a-PulN,以普鲁兰多糖为底物时其酶活为6.49U/mL。经过亲和色谱纯化后将纯酶进行SDS-PAGE检测分析,发现蛋白大小约为96kDa,与通过氨基酸序列推测的大小一致。根据Bradford法测定蛋白浓度计算得到纯酶的比活为13.1U/mg,以普鲁兰多糖为底物时,Km和Vmax值分别为15.25g/L,0.37g/(L.min)。普鲁兰酶纯酶的最适反应温度为35℃,在45℃以下温度条件都很稳定；其最适反应pH为6.0,在pH5.5-8.0内相对稳定。金属离子Mn2+和Co2+对Pu1N有明显的激活作用,而10mM的Cu2+可以使酶活全部丧失。EDTA不影响酶活。本文还研究了重组普鲁兰酶对底物的催化情况,计算了不同底物的相对酶活并进行了产物HPLC分析,从水解产物可以再次证明重组普鲁兰酶Pu1N为特异性水解α-1,6糖苷键的Ⅰ型普鲁兰酶。